李會宣 許冬倩 閆洪波

摘 要：苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL，EC4.3.1.5）是植物通過苯丙烷代謝途徑合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶和限速酶，其通過影響木質(zhì)素的合成而與果實中石細(xì)胞的分化、發(fā)育及果實品質(zhì)密切相關(guān)。為了降低鴨梨中苯丙氨酸解氨酶的含量，該研究利用反義PAL基因遺傳轉(zhuǎn)化鴨梨、降低鴨梨內(nèi)源PAL基因的表達(dá)。結(jié)果表明：（1）采用RT-PCR技術(shù)，利用根據(jù)GenBank中西洋梨PAL基因序列設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增得到496 bp的鴨梨PAL基因片段。（2）將擴(kuò)增片段反向插入載體pBI121的MCS區(qū)域，構(gòu)建植物PAL基因反義表達(dá)載體pBI121-AsPAL。接著采用電轉(zhuǎn)化法將反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，并制備出農(nóng)桿菌工程菌液。（3）利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對鴨梨組培苗葉片外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到23株轉(zhuǎn)基因鴨梨苗。PCR檢測證實PAL反義基因片段轉(zhuǎn)入鴨梨中，實時定量PCR檢測表明轉(zhuǎn)基因鴨梨苗體內(nèi)PAL基因表達(dá)量均有所降低，為非轉(zhuǎn)基因苗的65%～75%。該研究結(jié)果表明利用反義RNA技術(shù)獲得了抑制內(nèi)源性PAL基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鴨梨植株，為改善鴨梨果實品質(zhì)、改良品種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴨梨， 苯丙氨酸解氨酶， 反義RNA， 遺傳轉(zhuǎn)化， 基因表達(dá)

中圖分類號：Q943.2， S772.3， S661.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）04-0492-09

Abstract：Phenylalanine ammonia-lyase （PAL，EC4.3.1.5） catalyzes the first step from precursors to synthesizing lignin in phenylpropanoid pathway. Lignin accumulation is correlated with stone cell differentiation and fruit quality. In order to reduce the content of PAL， the antisense PAL gene transformed into Pyrus bretschneideri was used to reduce the expression of endogenous PAL gene in P. bretschneideri. According to pear PAL gene sequences in GenBank， a pair of primers were designed， and a 496 bp partial PAL gene fragment was amplified by RT-PCR. The PAL antisense expression vector pBI121-AsPAL was constructed by reverse inserting PAL gene fragment into pBI121 MCS region. The pBI121-AsPAL was transduced into Agrobacterium EHA105 by electro transformation method. Then， pBI121-AsPAL was transformed into tissue cultured P. bretschneideri plants mediated by Agrobacterium. Twenty-three transgenic lines harboring the anti-sense PAL fragment were verified by PCR. The Real-time PCR results showed that the expression level of endogenous PAL gene in transgenic plants was lower than that of non transgenic pear，with amount of non transgenic pear 65%-75%. The results showed that with transformation mediated by Agrobacterium， the expression of endogenous PAL gene was specifically inhibited in antisense RNA transgenic P. bretschneideri seedlings. Therefore， this study provides reference for improvement of the pear fruit quality and species.

Key words：Pyrus bretschneideri， phenylalanine ammonia-lyase， antisense RNA， genetic transformation， gene expression

鴨梨（Pyrus bretschneideri）作為中國的白梨品種，味甜多汁，香氣濃郁，營養(yǎng)豐富。梨果肉中的石細(xì)胞團(tuán)嚴(yán)重影響了梨果實的食用品質(zhì)（田路明等，2011；呂芮宏等，2011）。木質(zhì)素作為石細(xì)胞的主要成分，其合成是從苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸開始的（Kumar & Ellis，2001）。梨果實中的PAL首先參與木質(zhì)素單體的合成，然后在過氧化物酶的作用下聚合成為木質(zhì)素，進(jìn)而為石細(xì)胞的形成提供原料（Vanholme et al，2010）。因此，PAL為木質(zhì)素合成的第一個關(guān)鍵酶（Huang et al，2010），酶蛋白的合成與沉積以及酶蛋白的活性與石細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。

以往的研究主要集中在控制植物果實中PAL的活性，以期影響木質(zhì)素的含量、石細(xì)胞的形成，進(jìn)而影響果實品質(zhì)。王斌等（2013）和劉艷等（2011）的研究就發(fā)現(xiàn)梨石細(xì)胞含量與果實中PAL活性呈現(xiàn)極其顯著的正相關(guān)關(guān)系，果實套袋能夠降低PAL的活性，導(dǎo)致木質(zhì)素的合成減少、果實中石細(xì)胞的含量降低。鄒麗紅和張玉星（2012）對砂梨的研究也表明通過果實套袋抑制PAL活性，可以減低石細(xì)胞的含量、密度和大小，在一定程度上改進(jìn)了果品的品質(zhì)。物理方法雖然抑制了PAL的活性、降低木質(zhì)素的含量和石細(xì)胞的形成，但在改善果品品質(zhì)方面的作用有限。近年來，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化實現(xiàn)了對植物的遺傳改造，為進(jìn)一步改善植物果實或種質(zhì)品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)（陳曉艷等，2017；簡興等，2015）。隨著對鴨梨PAL基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)特性等方面研究的不斷深入（劉志浩等，2011；閆洪波等，2014），以及利用反義RNA技術(shù)抑制鴨梨多酚氧化酶、果膠甲酯酶及ACC氧化酶等基因的表達(dá)也有了成功先例（李桂琴等，2010；李會宣等，2014；齊靖等，2014），這些為利用反義RNA技術(shù)降低內(nèi)源性鴨梨PAL基因的表達(dá)水平，減少活性PAL的合成提供了理論參考和實驗經(jīng)驗?；诖?，本研究通過構(gòu)建鴨梨PAL基因的反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化鴨梨組培苗，以期獲得轉(zhuǎn)化反義PAL基因片段的鴨梨，為獲得PAL基因表達(dá)水平降低的轉(zhuǎn)基因植株、研究PAL在鴨梨中的作用以及為選育石細(xì)胞含量少的優(yōu)質(zhì)鴨梨品種提供參考，進(jìn)而為改良品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：鴨梨，河北省農(nóng)林科學(xué)院梨園栽植。載體和菌株：pUCm-T vector和大腸桿菌Top10購自上海生物工程公司，pBI121和根癌農(nóng)桿菌EHA105由本室保存。

試劑：Taq PCR Master Mix、Sac I和Xba I限制性內(nèi)切酶、氨芐青霉素（Amp）、鏈霉素（Str）、卡那霉素（Kan）、羧芐青霉素（Carb）、T4DNA ligase、連接試劑盒、IPTG、X-gal、Trizol試劑購自上海生物工程公司；基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、cDNA合成試劑盒購自天根生化科技有限公司； Primescript RT Reagent試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自寶生物工程公司；測序由上海生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參考GenBank公布的苯丙氨酸解氨酶基因PAL CDS序列（DQ901399.1）的核心區(qū)，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計上游引物FP1（5′-TTGAGCTCCAATTCCTTGGCAACCCT-3′）和下游引物RP1（5′-GCTCTAGAATAGGGTTTTCAGTTCCTCCTCAAA-3′），粗體部引入的Sac I和Xba I酶切位點。

1.2.2 目的基因的克隆和測序 利用Trizol法提取鴨梨葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

PCR擴(kuò)增：以cDNA作為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增PAL基因片段。反應(yīng)體系20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，循環(huán)30次，最后72 ℃ 保溫10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、與載體連接、轉(zhuǎn)化及鑒定：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收純化，純化產(chǎn)物與pUCm-T Vector連接。連接體系10 μL：PCR純化產(chǎn)物6 μL ，T4 DNA ligase 1 μL，10×T4 DNA Ligation buffer 1 μL，pUCm-T Vector 1 μL，50% PEG-4 000 1 μL。連接物采用熱激法轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑法篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒并進(jìn)行Sac I和Xba I雙酶切鑒定。10 μL的酶切體系：質(zhì)粒DNA 6 μL，Sac I 1 μL，Xba I 1 μL，10×buffer M 1 μL。重組質(zhì)粒酶切鑒定后送交上海生物工程公司測序，并命名為pUCm-T-AsPAL。

1.2.3 反義PAL基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將重組質(zhì)粒pUCm-T-PAL以及植物表達(dá)載體pBI121進(jìn)行Xba I/Sac I雙酶切，回收目的片段并進(jìn)行連接，由于pBI121中Sac I的酶切位點在下游，Xba I的酶切位點在上游，使得PAL基因片段反向與pBI121連接。連接物轉(zhuǎn)化E.coli Top10，PCR篩選陽性克隆，所用引物FP2（5′-TCTTTCGGCAATAGGGTTTTCAGT-3′）和RP2（5′-CAATTCCTTGGCAACCCTGTCA-3′）根據(jù)反向PAL基因片段設(shè)計。對PCR鑒定含有反向PAL基因片段的菌落，進(jìn)一步培養(yǎng)、提取質(zhì)粒，使用Xba I/Sac I酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pBI121-AsPAL。

1.3 反義PAL基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105

1.3.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 保存的農(nóng)桿菌EHA105進(jìn)行劃線分離，挑取單菌落接種于含Rif（50 mg·L-1）和Str（50 mg·L-1）的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃，220 r·min-1震蕩過夜培養(yǎng)活化，過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基，OD600≈0.6時離心收集菌體，用HEPES溶液和10%甘油洗滌，最后用10%甘油懸浮菌體，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 反義PAL基因植物表達(dá)載體電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞 將pBI121-AsPAL與農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞混勻，電壓2 500 V、4.3 ms電擊轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后菌液黑暗條件下，28 ℃，在含Kan（50 mg·L-1）、Rif（50 mg·L-1）和Str（50 mg·L-1）抗生素平板上倒置培養(yǎng)2 d。與此同時轉(zhuǎn)化pBI121作為陰性對照?？剐云桨迳祥L出的菌落先通過PCR篩選，在培養(yǎng)、提取質(zhì)粒用Xba I/Sac I酶切鑒定。正確的農(nóng)桿菌菌株用EHA105-pBI121-AsPAL表示，并用于制備工程菌液。

1.4 鴨梨的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)反義PAL基因無菌苗獲得

1.4.1 農(nóng)桿菌工程菌液的制備 在無菌條件下將保存的EHA105-pBI121-AsPAL菌液在含 Kan和Rif的 LB培養(yǎng)基上劃線，28 ℃倒置、暗培養(yǎng)。挑取單菌落接種于含同樣抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r·min-1，過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)后的菌液1∶50轉(zhuǎn)接于含同樣抗生素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，直至OD600=0.5～0.6，離心收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋10倍備用。同樣方法制備含pBI121空載體的農(nóng)桿菌菌液作為對照組工程菌液。

1.4.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化鴨梨及轉(zhuǎn)基因鴨梨組培苗的獲得 利用本室前期建立的再生轉(zhuǎn)化體系對鴨梨外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。取苗齡28 d的鴨梨無菌組培苗葉片作為外植體，置于EHA105-pBI121-AsPAL工程菌液或含pBI121空載體的農(nóng)桿菌工程菌液中，浸染5 min后，將離體葉片放置于誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基（S 30 g·L-1+BA 4.0 g·L-1+IAA 0.3 g·L-1+MS+Agar 4.0 g·L-1 （pH5.8） + Kan 50 mg·L-1）共培養(yǎng)2 d。轉(zhuǎn)入添加200 mg·L-1羧芐青霉素的誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行殺菌和誘導(dǎo)培養(yǎng)愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)入再生芽選擇培養(yǎng)基（S 30 g·L-1+BA 3.0 g·L-1+IAA 0.5 g·L-1+Carb 200 mg·L-1+Kan 50 mg·L-1 MS+Agar 4.0 g·L-1 （pH5.8））誘導(dǎo)抗性不定芽再生。切下4～6 cm的抗性不定芽并置于抗性苗篩選培養(yǎng)基（S 30 g·L-1+1/2MS+IBA 1.0 g·L-1+Agar 4.0 g·L-1 （pH5.8）+Carb 200 mg·L-1+ Kan 20 mg·L-1）上誘導(dǎo)生根、擴(kuò)繁、并進(jìn)行檢測。

1.4.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 按照TaKaRA公司的基因組提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因鴨梨葉片基因組DNA，使用FP2、RP2引物，利用PCR檢測鴨梨抗性植株pBI121中插入的反向PAL基因片段，含pBI121空載體的農(nóng)桿菌工程菌液侵染外植體后誘導(dǎo)再生的鴨梨苗作為對照。同時，使用NPTII基因序列設(shè)計的引物N1（5′-ATGATTAACAAGATGGATTGCA-3′）和N2（5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3′），通過PCR檢測pBI121質(zhì)粒，擴(kuò)增片段的長度為778 bp。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)AL表達(dá)水平檢測

采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株中PAL基因的表達(dá)水平。Trizol試劑提取鴨梨葉片總RNA，經(jīng)過DNase I酶解、消化后，利用寶生物工程公司的Primescript RT Reagent試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為qRT-PCR模板。利用ABI公司的 PRISM 7 500實時熒光定量PCR系統(tǒng)，按照寶生物公司SYBR Premix Ex TaqTM說明書，兩步法完成熒光定量PCR，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)：95 ℃預(yù)變性30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 變性10 s，60 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。內(nèi)參為鴨梨actin2基因（GU830958.1），A1（5′-GGACATTCAACCCCTCGTCT-3′）和A2（5′-ATCCTTCTGACCCATACCAACC-3′）作為正、反向引物，轉(zhuǎn)入的反向PAL基因片段使用FP2和RP2作為正、反向引物。反應(yīng)結(jié)束后，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel表，根據(jù)得到的Ct值，運(yùn)用Livak 和 Schmitten報道的 2-△△CT方法計算目的PAL基因mRNA相對表達(dá)量。使用DPS軟件進(jìn)行差異的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨梨PAL基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 鴨梨PAL基因片段的克隆及鑒定 以鴨梨葉片cDNA為模板，用PCR技術(shù)擴(kuò)增PAL基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測表明（圖1：A），擴(kuò)增得到約500 bp特異性的單一條帶，大小與預(yù)期相符。將擴(kuò)增片段與pUCm-T 載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行Xba I/Sac I雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物包含一個約500 bp小片段和一個約2 800 bp的大片段，而空載pUCm-T載體只有一個約2 800 bp大片段（圖1：B）。重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-PAL，送交上海生物工程公司測序進(jìn)行測序，結(jié)果表明插入片段為496 bp，與GenBank中的西洋梨PAL序列（DQ901399.1）的一致性極高（圖1：C），因此認(rèn)定pUCm-T-PAL含有鴨梨PAL基因核心區(qū)496 bp的片段。

2.1.2 鴨梨PAL基因反義表達(dá)載體pBI121-AsPAL的構(gòu)建 利用Xba I和Sac I酶切植物表達(dá)載體pBI121（切去1.9 kb Gus結(jié)構(gòu)基因，并且保留CaMv35S、Nos等部分），與496 bp的目的PAL基因片段連接，由于Xba I/Sac I在載體和片段上的上、下游位置相反，使得目的PAL基因片段反向與載體pBI121連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那霉素抗性篩選重組質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定。一方面，以引物FP2和RP2（反向PAL基因片段的上、下游引物）對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳（圖2：A）。另一方面，通過Xba I/Sac I對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到約496 bp的特異條帶（圖2：B）。綜上結(jié)果表明，PAL基因片段已反向插入植物表達(dá)載體pBI121中，鴨梨PAL基因反義表達(dá)載體pBI121-AsPAL構(gòu)建成功。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鴨梨PAL反義基因的遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

2.2.1 PAL基因反義表達(dá)載體pBI121-AsPAL轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及PCR鑒定 用電擊法將鴨梨PAL基因反義表達(dá)載體pBI121-AsPAL轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105細(xì)胞，與此同時轉(zhuǎn)化pBI121 作為對照，培養(yǎng)后挑取單菌落用引物FP2和RP2對農(nóng)桿菌菌落進(jìn)行PCR鑒定（圖3）。圖3結(jié)果表明，pBI121-AsPAL轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。含pBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌命名為EHA105-pBI121，含反義表達(dá)載體pBI121-AsPAL的農(nóng)桿菌命名為EHA105-pBI121-AsPAL，并作為遺傳轉(zhuǎn)化的工程菌液。

2.2.2 轉(zhuǎn)PAL反義基因片段的鴨梨組培苗的獲得及PCR檢測 參照李桂琴等（2010）構(gòu)建的鴨梨的遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系進(jìn)行鴨梨反義PAL基因的遺傳轉(zhuǎn)化。鴨梨葉片外植體經(jīng)EHA105-pBI121或EHA105-pBI121-AsPAL工程菌液侵染后，經(jīng)過再生培養(yǎng)基、再生芽選擇培養(yǎng)基、抗性苗篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后，最終獲得具有卡那霉素抗性的鴨梨組培苗95株。提取再生的抗性鴨梨苗總DNA，利用擴(kuò)增NPT II基因序列的特異性引物N1和N2以及PAL基因反向序列的引物FP2和RP2，對抗性鴨梨苗進(jìn)行PCR鑒定。其中，以pBI121-AsPAL質(zhì)粒作為PCR的陽性對照，陰性對照為非轉(zhuǎn)基因植株，同時還輔以轉(zhuǎn)pBI121鴨梨苗對照。95株抗性鴨梨苗中，PCR鑒定23株含有反義PAL基因片段，陽性率為24.2%。部分結(jié)果如圖4所示，抗性鴨梨苗（4-6泳道、10-12泳道）分別擴(kuò)增得到800 bp和496 bp特異條帶，符合NPTII和反向PAL基因片段的預(yù)期長度，證明轉(zhuǎn)基因鴨梨苗基因組中含有外源的PAL反向基因，即抗性鴨梨苗為轉(zhuǎn)PAL反義基因再生組培苗。

2.3 轉(zhuǎn)基因鴨梨苗PAL基因表達(dá)水平檢測

提取轉(zhuǎn)基因鴨梨苗葉片總RNA，利用RT-qPCR方法，以非轉(zhuǎn)基因鴨梨苗作為對照，檢測轉(zhuǎn)基因鴨梨苗中PAL基因的表達(dá)水平。檢測結(jié)果表明，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PAL反義基因的遺傳轉(zhuǎn)化，與對照組非轉(zhuǎn)基因鴨梨苗（其PAL基因表達(dá)量設(shè)定為1）相比，23株轉(zhuǎn)基因鴨梨苗中PAL基因表達(dá)量都有所降低，分別為對照的65%～75%，其中相對表達(dá)量最低的為對照的65.1%、 最高的為對照的75.2%。圖5列出了部分轉(zhuǎn)pBI121-AsPAL鴨梨苗和轉(zhuǎn)pBI121鴨梨苗中PAL基因的相對表達(dá)量。組1、組2和組3中轉(zhuǎn)pBI121-AsPAL鴨梨苗PAL基因相對表達(dá)量，與PAL基因相對表達(dá)量設(shè)定為1的對照非轉(zhuǎn)基因鴨梨苗相比，分別為68.14%、70.87%和73.20%，均低于1，表明轉(zhuǎn)pBI121-AsPAL鴨梨苗中PAL基因的表達(dá)量低于非轉(zhuǎn)基因苗，即轉(zhuǎn)pBI121-AsPAL鴨梨苗中PAL基因的表達(dá)受到了抑制；而轉(zhuǎn)化pBI121的鴨梨苗中，PAL基因相對表達(dá)量分別為非轉(zhuǎn)基因苗的102.81%、111.21%和101.39%，雖然與PAL基因表達(dá)量為1的非轉(zhuǎn)基因苗有所不同，但差異不顯著，表明轉(zhuǎn)pBI121鴨梨苗與非轉(zhuǎn)基因鴨梨苗中PAL基因表達(dá)沒有差異。因此，即轉(zhuǎn)入PAL反義基因的鴨梨苗中內(nèi)源PAL基因的表達(dá)在一定程度上均受到了抑制，發(fā)揮抑制作用的是PAL反義基因表達(dá)載體pBI121-AsPAL，而非pBI121空載體。

3 討論與結(jié)論

石細(xì)胞的主要成分為木質(zhì)素，由薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁強(qiáng)烈增厚形成，是影響鴨梨果實品質(zhì)的重要因素。目前發(fā)現(xiàn)的影響梨木質(zhì)素合成以及石細(xì)胞含量、發(fā)育的有PPO（李玲等，2011）、PAL（閆洪波等，2014）、F5H（徐超等，2015）、COMT（程敏等，2015）、PbCCoAOMT（王丹陽等，2015）、POD4（李文慧等，2017）基因等，其中PAL是木質(zhì)素合成的首個關(guān)鍵酶基因。因此，可以通過基因表達(dá)調(diào)控控制PAL的生成量，調(diào)節(jié)木質(zhì)素的代謝，抑制石細(xì)胞的形成和發(fā)育，從而提高梨果實的口感及經(jīng)濟(jì)價值。借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的反義RNA或RNAi技術(shù)，可以特異性調(diào)控基因在生物體內(nèi)的表達(dá)。本研究根據(jù)西洋梨PAL基因序列設(shè)計引物，通過RT-PCR擴(kuò)增得到496 bp的PAL基因片段，并連接到植物表達(dá)載體pBI121，構(gòu)建鴨梨PAL基因特異性反義表達(dá)載體pBI121-AsPAL。利用電擊法將pBI121-AsPAL轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，制備EHA105-pBI121-AsPAL工程菌液。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將pBI121-AsPAL導(dǎo)入鴨梨，最終獲得了轉(zhuǎn)化PAL反義基因片段的轉(zhuǎn)基因鴨梨。實時定量PCR對轉(zhuǎn)基因鴨梨的PAL表達(dá)分析表明，反義PAL基因的遺傳轉(zhuǎn)化降低了鴨梨內(nèi)源PAL基因的表達(dá)，為特異性抑制鴨梨PAL活性奠定了基礎(chǔ)，也為應(yīng)用反義RNA技術(shù)改善鴨梨果實品質(zhì)再次提供理論參考。

在以往對鴨梨PAL基因的研究中發(fā)現(xiàn)了兩個基因，即家族成員PbPAL1（GU906268.1）和PbPAL2（GU906269.1），與大多數(shù)植物一樣，均含有一個內(nèi)含子（閆洪波等，2014）。兩個基因編碼的蛋白在分子大小、結(jié)構(gòu)、帶電荷特性等方面沒有明顯的差異，但在果實發(fā)育期過程中二者的表達(dá)量卻存在差異，說明PAL不同基因家族成員在果實發(fā)育的不同階段可能發(fā)揮著不同的功能（閆洪波等，2014）。本研究根據(jù)西洋梨PAL基因設(shè)計引物，擴(kuò)增序列與PbPAL1和PbPAL2序列存在極大差異，推測原因可能是PbPAL1和PbPAL2的CDS區(qū)是根據(jù)GenBank中蘋果EST序列設(shè)計的兩對引物擴(kuò)增得到的。雖然，蘋果的61個EST-SSR和68個SSR可以定位于梨的連鎖圖上，證實蘋果和梨二者的基因組結(jié)構(gòu)存在保守性，但不同類型基因以及基因的不同區(qū)域在進(jìn)化過程中還存在保守性差異（施澤彬等，2011；韓明麗等，2010）。與本研究一樣，劉志浩等（2011）也根據(jù)西洋梨PAL基因（DQ901399.1）保守區(qū)的序列設(shè)計引物，使用鴨梨果實cDNA模板，擴(kuò)增得到了478 bp的PAL基因cDNA片段（GU355673），雖然與本文中擴(kuò)增得到的496 bp序列在西洋梨PAL基因序列中的位置有所不同，但二者與西洋梨的PAL基因CDS序列的同源性都達(dá)到了99%。因此推測在鴨梨中可能還存在除PbPAL1和PbPAL2以外的基因家族成員，這有待于進(jìn)一步的研究和證實。通過以上對基因的深入研究，也有待于將鴨梨PAL基因信息應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化，基于此，本研究利用反義PAL基因遺傳轉(zhuǎn)化鴨梨，為進(jìn)一步應(yīng)用于遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

對鴨梨PAL基因家族基因表達(dá)水平分析表明，PAL作為合成酚類物質(zhì)關(guān)鍵酶參與了鴨梨幼果期木質(zhì)素和石細(xì)胞的合成，而且在果實發(fā)育過程中PAL基因的表達(dá)存在明顯差異（閆洪波等，2014）。以往的研究也證實反義RNA技術(shù)在轉(zhuǎn)基因鴨梨的愈傷組織以及幼苗中表現(xiàn)出了良好的效果（李會宣等，2014；齊靖等，2014）。本研究中得到的23株轉(zhuǎn)基因鴨梨苗中，PAL基因的表達(dá)量均有所降低，為對照的65%～75%不等，達(dá)到了利用反義RNA技術(shù)抑制基因表達(dá)的效果。雖然都表現(xiàn)出了抑制內(nèi)源基因表達(dá)的作用，但轉(zhuǎn)基因鴨梨苗中PAL基因表達(dá)降低的幅度不盡相同，可能與環(huán)境或植株個體特異性影響基因的表達(dá)有關(guān)。鴨梨屬于木本科植物，營養(yǎng)生長期較長，本研究也只對PAL基因的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的鴨梨苗進(jìn)行了證實和鑒定，并未能夠?qū)D(zhuǎn)基因植株各個生長期以及植株各個部位的PAL基因表達(dá)情況進(jìn)行系統(tǒng)檢測和研究。因此，后期研究主要針對轉(zhuǎn)基因鴨梨不同時期、不同部位的PAL基因的表達(dá)情況的分析，尤其是果實發(fā)育期，對PAL基因的表達(dá)及PAL的活性進(jìn)行分析，為開發(fā)鴨梨種質(zhì)資源和提升果品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

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