智亞楠 陳月華 陳平 陳利軍 史洪中

摘要：【目的】明確藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油的組分及其對(duì)植物病原真菌的熏蒸抑制活性，為藍(lán)冰柏在農(nóng)林業(yè)上的應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎盟魵庹麴s法提取藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油，利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析其化學(xué)組分，并測(cè)定分析藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)草莓灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌和蘋果炭疽病菌等4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的熏蒸抑制作用?！窘Y(jié)果】從藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油中共分離到44種組分，鑒定出其中30種組分，占揮發(fā)油總量的91.241%，其主要組分為傘形酮（16.416%）、順式—依蘭油-4，5-二烯（14.765%）、4-萜烯醇（12.111%）和右旋檸檬烯（7.044%）等。藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)供試草莓灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌和蘋果炭疽病菌均有一定的熏蒸抑制作用，有效中濃度（EC50）分別為0.91、2.27、0.84和4.12 μL/皿?！窘Y(jié)論】藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)有一定的熏蒸抑制作用，其活性成分可作為先導(dǎo)化合物用于開發(fā)新型農(nóng)藥或直接作為殺菌劑應(yīng)用于植物病害防控。

關(guān)鍵詞： 藍(lán)冰柏；熏蒸抑菌活性；揮發(fā)油；化學(xué)組分

中圖分類號(hào)： S476 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）08-1555-06

0 引言

【研究意義】植物揮發(fā)油是從植物中提取獲得的一類具有特征性香氣物質(zhì)（徐漢虹，2001），其成分復(fù)雜，安全性較高（李燕君等，2016），已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和食品（Paul et al.，2007；周曉薇等，2010；鐘曼茜等，2017）等行業(yè)，因具有農(nóng)用活性（張興等，2015），在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也有應(yīng)用，如辣薄荷揮發(fā)油對(duì)四紋豆象（Raja et al.，2001）和家蠅（Sinthusiri and Soonwera，2014）具有殺蟲活性；土荊芥（陳利軍等，2014）、小魚仙草（陳利軍等，2016）和黃花蒿（智亞楠等，2016）等植物揮發(fā)油對(duì)多種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用。揮發(fā)油中的天然活性成分如4-萜烯醇、丁香酚、香芹酮、1，8-桉葉素和麝香草酚對(duì)鐮刀菌屬、曲霉菌屬和青霉菌屬等真菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用（Morcia et al.，2012）。藍(lán)冰柏（Cupressus glabra ‘Blue Ice）為柏科柏木屬，是歐美傳統(tǒng)的圣誕樹首選樹種，目前已在我國(guó)批量生產(chǎn)和推廣。藍(lán)冰柏株形垂直整潔且緊湊，常年不落葉，葉片呈霜藍(lán)色，是常用的觀賞類彩葉植物。因其樹姿優(yōu)美，移植成活率高，已成為我國(guó)廣泛種植的園林樹種之一（邵紅瓊，2013）。藍(lán)冰柏很少受病蟲侵染，是否與自身產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)有關(guān)值得深入研究和探討?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】藍(lán)冰柏和大多數(shù)柏科植物一樣具有濃郁的芳香氣味，含有豐富的揮發(fā)油，但目前未見(jiàn)藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油活性成分的研究報(bào)道。已有學(xué)者對(duì)多種柏科植物的揮發(fā)油組分及活性進(jìn)行了研究。王淳凱等（2008）通過(guò)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析地中海柏?fù)]發(fā)油的組分，共鑒定出38種化合物，其主要成分為羅漢柏烯、α-柏木烯和α-雪松醇，并通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地中海柏?fù)]發(fā)油對(duì)活性氧自由基具有顯著的清除作用，對(duì)肝組織質(zhì)脂過(guò)氧化物的形成有很好的抑制作用，在體外能有效抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。黃傳奇等（2013）采用水蒸氣蒸餾法提取北美圓柏和側(cè)柏的揮發(fā)油，并測(cè)定了兩種揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、黑曲霉、釀酒酵母菌、大腸桿菌和沙門氏菌等常見(jiàn)細(xì)菌的抑制活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種揮發(fā)油對(duì)供試細(xì)菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制活性，與對(duì)照藥劑四環(huán)素相比有明顯的優(yōu)勢(shì)。吳彥等（2015）報(bào)道，側(cè)柏葉揮發(fā)油的主要成分為α-蒎烯、雪松醇、3-蒈烯和石竹烯等，通過(guò)硅膠柱層析分離揮發(fā)油，共得到3種單體化合物，分別為α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇，并發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油及其活性單體對(duì)煙草甲和赤擬谷盜有良好的觸殺和熏蒸活性。張育光等（2015）采用亞臨界流體萃取技術(shù)提取崖柏?fù)]發(fā)油，并對(duì)萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，用GC-MS對(duì)所得的崖柏?fù)]發(fā)油進(jìn)行了組分分析，主要組分是羅漢柏烯和α-柏木腦。【本研究切入點(diǎn)】藍(lán)冰柏資源豐富，已在我國(guó)多地成功引種，但尚未見(jiàn)其揮發(fā)油化學(xué)組分分析及其抗菌活性的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取藍(lán)冰柏的揮發(fā)油，利用GC-MS分析其化學(xué)組分及其含量，并以草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosparioides）4種植物病原真菌為目標(biāo)菌，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)4種病原菌菌絲生長(zhǎng)的熏蒸抑制作用，以期為藍(lán)冰柏在農(nóng)林業(yè)上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試藍(lán)冰柏于2016年6月采自河南省信陽(yáng)市百花園，采其健康、新鮮枝葉備用，提取揮發(fā)油。供試植物病原真菌：草莓灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌和蘋果炭疽病菌均由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室分離保存。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖18 g、瓊脂17 g、水1000 mL。

主要儀器設(shè)備：Agilent 6850/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）、NIST14譜庫(kù)、HP-250S生化培養(yǎng)箱（武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）和水蒸氣蒸餾裝置（金壇市恒豐儀器制造有限公司）等。

1. 2 藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油（李植飛等，2015）。將藍(lán)冰柏新鮮枝葉剪成0.5 cm的小段，稱取200 g裝入5 L的圓底燒瓶中，加入3000 mL蒸餾水浸泡3 h，連續(xù)蒸餾提取2 h后，收集揮發(fā)油（淺黃色具濃郁氣味的油狀液體），4 ℃密封保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)重復(fù)3次。

油含率（%）= 揮發(fā)油體積/樣品質(zhì)量×100

1. 3 藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油熏蒸抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油的熏蒸抑菌作用（陳利軍等，2014）。在90 mm培養(yǎng)皿中加入融化的PDA培養(yǎng)基，制成厚薄均勻的平板，平板中央接種直徑為5 mm的植物病原真菌菌餅。在皿蓋上放置1張滅菌的圓形濾紙片，濾紙片上滴加一定劑量的揮發(fā)油。皿底皿蓋對(duì)扣后，用Parafilm封口膜密封，倒置培養(yǎng)，72 h后觀察真菌的生長(zhǎng)情況，并采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。不同病原真菌使用的揮發(fā)油劑量根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，以僅放置1張濾紙片不滴加揮發(fā)油為對(duì)照。各試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

利用SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立毒力回歸方程，并求得相關(guān)系數(shù)和有效中濃度（EC50）。

1. 4 藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油化學(xué)組分測(cè)定

色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度260 ℃；程序升溫，初始柱溫為60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1.0 μL，進(jìn)樣前藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油用乙醚稀釋800倍。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電離能量70 eV，離子源溫度220 ℃，掃描范圍33～350 amu。

2 結(jié)果與分析

2. 1 藍(lán)冰柏中揮發(fā)油的油含率

經(jīng)計(jì)算，采用水蒸氣蒸餾法提取藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油的油含率為0.53%。

2. 2 藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油的化學(xué)組分分析結(jié)果

GC-MS分析藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油化學(xué)組分的總離子流，結(jié)果見(jiàn)圖1。利用色譜峰面積歸一法測(cè)得各組分的相對(duì)含量，所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)，并結(jié)合CAS號(hào)分析鑒定各組分。結(jié)果從藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油中共分離出44種組分，鑒定出30種組分（表1），占揮發(fā)油總量的91.241%。

從表1可看出，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油中相對(duì)含量最高的組分為傘形酮（16.416%），其次為順式—依蘭油-4，5-二烯（14.765%）、4-萜烯醇（12.111%）和右旋檸檬烯（7.044%）等，在已鑒定的化合物中，單萜類及其含氧衍生物18種，占揮發(fā)油總量的48.896%；倍半萜類及其含氧衍生物8種，占揮發(fā)油總量的35.655%。

2. 3 藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)植物病原真菌的熏蒸抑制作用

從表2可看出，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)供試4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均具有一定的熏蒸抑制作用，抑制作用隨揮發(fā)油劑量的增加而增強(qiáng)。本研究選用的最小濃度為0.50 μL/皿，最大濃度為10.00 μL/皿，當(dāng)濃度為1.00 μL/皿時(shí)，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)草莓灰霉病菌和小麥赤霉病菌的抑菌率均超過(guò)50.00%；當(dāng)濃度為4.00 μL/皿時(shí)，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)草莓灰霉病菌的抑菌作用最明顯，抑菌率達(dá)90.03%，對(duì)油菜菌核病菌和小麥赤霉病菌的抑菌率均超過(guò)70.00%，對(duì)蘋果炭疽病菌的抑菌率最低，為32.08%；當(dāng)濃度為7.00 μL/皿時(shí)，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)油菜菌核病菌和小麥赤霉病菌的抑菌率均超過(guò)90.00%；當(dāng)濃度為10.00 μL/皿時(shí)，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)蘋果炭疽病菌的抑菌率為82.08%。

藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用毒力測(cè)定結(jié)果（表3）表明，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)草莓灰霉病菌和小麥赤霉病菌的抑制效果良好，EC50均小于1.00 ?L/皿，分別為0.91和0.84 ?L/皿；藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)油菜菌核病菌的EC50為2.27 ?L/皿；藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)蘋果炭疽病菌的抑制效果較弱，EC50為4.12 ?L/皿。

3 討論

本研究通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取藍(lán)冰柏的揮發(fā)油，其主要組分為傘形酮（16.416%）、順式—依蘭油-4，5-二烯（14.765%）、4-萜烯醇（12.111%）和右旋檸檬烯（7.044%）等，與已報(bào)道的柏科植物揮發(fā)油組分差異明顯。吳穎等（2015）報(bào)道扁柏?fù)]發(fā)油主要成分為5-蒈醇、欖香醇和大根香葉烯等；姚莉等（2005）報(bào)道的岷江柏葉揮發(fā)油、雷華平等（2016）報(bào)道的側(cè)柏?fù)]發(fā)油中含有傘形酮，但含量較低；雷華平等（2016）報(bào)道側(cè)柏?fù)]發(fā)油的主要成分為α-蒎烯、3-蒈烯和雪松醇等。這些差異可能是由于柏科植物種類多，不同的屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、生境不同所造成。

柏科植物揮發(fā)油具有多方面的活性。Krauze-Baranowska等（2002）發(fā)現(xiàn)小側(cè)柏?fù)]發(fā)油對(duì)鐮刀菌有一定的抑制作用。蔣繼宏等（2006）測(cè)定了刺柏、圓柏、龍柏、日本扁柏和絨柏5種柏屬植物揮發(fā)油的組分，發(fā)現(xiàn)幾種揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞均有抑制效果。園柏和龍柏?fù)]發(fā)油（崔艷秋等，2006）、日本花柏心材揮發(fā)油（劉志明等，2011）對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌均有抑制作用。Wedge等（2009）發(fā)現(xiàn)兩種刺柏屬植物方枝柏和高山柏?fù)]發(fā)油對(duì)尖孢炭疽菌（C. acutatum）、草莓炭疽菌（C. fragariae）和膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）均有抑制作用，但抑制效果不如苯菌靈和克菌丹；而在殺蟲活性測(cè)定中兩種揮發(fā)油在低劑量條件下對(duì)杜鵑網(wǎng)蝽的致死率高于馬拉硫磷。藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油中所含組分4-萜烯醇（Morcia et al.，2012）和右旋檸檬烯（DAlessio et al.，2013）已被證實(shí)具有抑菌活性，同時(shí)是許多種植物揮發(fā)油成分的重要組成部分。傘形酮屬于香豆素類化合物，廣泛存在于苦竹屬和牡竹屬等植物的葉片中，香豆素類化合物具有多方面的藥理活性，有很高的藥用價(jià)值，也可作為香料使用（魏琦等，2014）。而另外一種含量較高的組分順式—依蘭油-4，5-二烯的理化性質(zhì)和生物活性未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，有待得到單體之后進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)供試4種植物病原真菌均有強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，對(duì)4種真菌菌絲生長(zhǎng)的熏蒸抑制作用EC50介于0.84～4.12 μL/皿，其中揮發(fā)油對(duì)草莓灰霉病菌和小麥赤霉病菌的抑制效果良好，EC50小于1.00 ?L/皿?？梢?jiàn)，藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油具有作為熏蒸型殺菌劑的潛力和開發(fā)前景。藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油化學(xué)組分復(fù)雜，其抑菌作用是基于4-萜烯醇和右旋檸檬烯等的活性，或是幾種其他組分參與抑菌，哪種組分活性高等均有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究采用GC-MS從藍(lán)冰柏提取的揮發(fā)油中分離出44種組分，鑒定了30種組分，主要組分為傘形酮、順式—依蘭油-4，5-二烯、4-萜烯醇和右旋檸檬烯等。藍(lán)冰柏?fù)]發(fā)油對(duì)植物病原真菌菌絲的生長(zhǎng)具有熏蒸抑制作用，其活性成分可作為先導(dǎo)化合物用于開發(fā)新型農(nóng)藥或直接作為殺菌劑應(yīng)用于植物病害防控。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）