王祁民 安靜 李穎 馬銀玲 董占軍

中圖分類號(hào) R28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）08-1048-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.09

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷A、H、I含量的方法。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，色譜柱為Phenomenex Kinetex XB-C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫）， 流速為 0.2 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，離子源為電噴霧離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式，正離子掃描，離子源噴射電壓為5 500 V，霧化氣壓力為60 psi，加熱氣壓力為60 psi，簾氣壓力為20 psi，去溶劑溫度為600 ℃。結(jié)果：通關(guān)藤苷A、H、I檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.1～10 ng/mL（r=0.999 7）、0.025～10 ng/mL（r=0.999 5）、0.025～10 ng/mL（r=0.998 9）；定量限分別為0.1、0.025、0.025 ng/mL，檢測(cè)險(xiǎn)分別為0.05、0.012 5、0.012 5 ng/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于4.0%；加樣回收率分別為97.67%～99.00%（RSD=0.47%，n=6）、95.00%～101.67%（RSD=2.59%，n=6）、96.67%～103.33%（RSD=2.83%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷A、H、I含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 通關(guān)藤；通關(guān)藤苷A；通關(guān)藤苷H；通關(guān)藤苷I；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I in Marsdenia tenacissima. METHODS： UPLC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on a Phenomenex Kinetex XB-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃， and sample size was 5 μL. Multiple reaction monitoring （MRM） mode was adopted with electrospray ion source as ion source， using positive ion scanning. Source jet voltage was 5 500 V， nebulizer pressure was 60 psi， heating pressure was 60 psi， curtain pressure was 20 psi and cone temp was set at 600 ℃. RESULTS： The linear ranges of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I were 0.1-10 ng/mL （r=0.999 7）， 0.025-10 ng/mL（r=0.999 5）， 0.025-10 ng/mL（r=0.998 9）， respectively； limited of quantation were 0.1，0.025，0.025 ng/mL，limited of detection were 0.05，0.012 5，0.012 5 ng/mL， respectively； RSDs of precision， stability and reproducibility tests were<4.0%. The recoveries were 97.67%-99.00%（RSD=0.47%，n=6）， 95.00%-101.67%（RSD=2.59%，n=6）， 96.67%-103.33%（RSD=2.83%，n=6）. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible， and can be used for simultaneous determination of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I in M. tenacissima.

KEYWORDS Marsdenia tenacissima； Tenacissoside A； Tenacissoside H； Tenacissoside I； UPLC-MS/MS

通關(guān)藤[Marsdenia tenacissima（Roxb.） Wight et Arn.]又名烏骨藤、通光藤、通關(guān)散、奶漿藤等，收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部），分布于我國(guó)云南、貴州等地，入藥部位為其干燥藤莖，有止咳平喘、祛痰、通乳、清熱解毒等功效[1-3]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道多集中于通關(guān)藤藥材中酚酸類物質(zhì)[4-7]，近期研究顯示通關(guān)藤藥材主要活性成分為甾體皂苷類化合物[3]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中通關(guān)藤藥材的含量測(cè)定項(xiàng)是以通關(guān)藤苷H為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行檢測(cè)的。隨著對(duì)該藥材研究的不斷深入，鑒定分離的通關(guān)藤苷種數(shù)不斷增加[2-3]，有文獻(xiàn)報(bào)道了采用HPLC法測(cè)定通關(guān)藤藥材及其制劑中通關(guān)藤苷的方法[8-10]。本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）建立同時(shí)測(cè)定通關(guān)藤藥材中通關(guān)藤苷A、H、I含量的方法，以期為更好地對(duì)該藥材進(jìn)行質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UPLC-30A型UPLC系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）； AB Sciex Triple QuadTM 5500 型串聯(lián)四極桿線性離子阱MS儀（美國(guó)Sciex公司）；AB204-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

通關(guān)藤苷A對(duì)照品（山西省中醫(yī)藥研究院，批號(hào)：20130513，純度：>98.3%）；通關(guān)藤苷H對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111913-201202，純度：>98%）；通關(guān)藤苷I對(duì)照品（深圳遠(yuǎn)揚(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20160311，純度：>98%）；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

通關(guān)藤藥材 （國(guó)藥樂仁堂石家莊藥材有限公司，批號(hào)：160132、160320、160521，產(chǎn)地：云南）經(jīng)河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部董占軍主任藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18（50 mm×2.1 mm， 2.6 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，40%B；1～2 min，40%B→90%B；2～4 min，90%B；4～4.01 min，90%B→40%B；4.01～6 min，40%B）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM），正離子掃描；離子源噴射電壓：5 500 V；霧化氣（gas 1）壓力：60 psi；加熱氣（gas 2）壓力：60 psi；簾氣壓力：20 psi；去溶劑溫度：600 ℃；其余質(zhì)譜分析參數(shù)見表1（表中DP為解簇電壓，CE為碰撞能量）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取待測(cè)成分對(duì)照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得通關(guān)藤苷A、H、I質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液，于 4 ℃貯藏，備用。精密量取上述單一對(duì)照品貯備液各10 μL，分別置于量瓶中，加甲醇定容至1 mL，得通關(guān)藤苷A、H、I質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的單一對(duì)照品溶液。精密量取上述單一對(duì)照品溶液各適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，得通關(guān)藤苷A、H、I質(zhì)量濃度均為100 ng/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末（過3號(hào)篩）1.006 g，置于錐形瓶中，加甲醇40 mL，稱定質(zhì)量，密塞，超聲（功率：120 W，頻率：40 kHz）處理25 min，冷卻，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，得供試品溶液Ⅰ；精密量取上述供試品溶液Ⅰ10 μL，置于量瓶中，加甲醇稀釋并定容至200 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 缺藥材樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，得陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各5 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，各待測(cè)成分出峰時(shí)間穩(wěn)定，峰形良好，陰性對(duì)照無干擾，色譜見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成通關(guān)藤苷A、H、I質(zhì)量濃度均為10、8、4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025 ng/mL的系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各5 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以通關(guān)藤苷A、H、I質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程與線性范圍見表2。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限，詳見表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1 ng/mL混合對(duì)照品溶液適量， 按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，通關(guān)藤苷 A、H、I峰面積的RSD分別為2.46%、1.53%、3.22%（n=6），表明日內(nèi)精密度良好。按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)測(cè)定3 d，記錄峰面積。結(jié)果，通關(guān)藤苷 A、H、I峰面積的RSD分別為3.26%、2.67%、3.81%（n=6），表明日間精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：160132）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，通關(guān)藤苷A、H、I峰面積的RSD分別為3.83%、1.51%、2.85%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取藥材樣品（批號(hào)：160132）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，通關(guān)藤苷A、H、I含量平均值分別為6.35、1.27、0.62 mg/g，RSD分別為 3.16%、3.74%、2.71%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：160132）適量，每份0.5 g，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 耐用性試驗(yàn)

2.10.1 色譜柱考察 取藥材藥品（批號(hào)：160132）質(zhì)量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件[色譜柱分別為Phenomenex Kinetex XB-C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Accucore C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）、 Cosmocore C18（50 mm×2.1 mm， 2.6 μm）]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，詳見表4。結(jié)果表明，本試驗(yàn)條件在一定色譜柱變動(dòng)情況下耐用。

2.10.2 流動(dòng)相考察 取藥材藥品（批號(hào)：160132）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件（流動(dòng)相中甲酸溶液體積分?jǐn)?shù)分別為0.05%、0.15%、0.20%）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，詳見表4。結(jié)果表明，本試驗(yàn)條件在一定流動(dòng)相變動(dòng)情況下耐用。

2.10.3 流速考察 取藥材藥品（批號(hào)：160132）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件（流速分別為0.15、0.20、0.25 mL/min ）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，詳見表4。結(jié)果表明，本試驗(yàn)條件在一定流速變動(dòng)情況下耐用。

2.10.4 柱溫考察 取藥材藥品（批號(hào)：160132）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件（柱溫別為25、30、35 ℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，詳見表4。結(jié)果表明，本試驗(yàn)條件在一定柱溫變動(dòng)情況下耐用。

2.11 藥材樣品含量測(cè)定

取3批藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品含量，結(jié)果見表5。

3 討論

通關(guān)藤藥材及其制劑在臨床上應(yīng)用日益廣泛，但缺乏其質(zhì)量控制的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，通關(guān)藤藥材含多種成分，包括酚酸類、C21甾體皂苷類、甾醇/環(huán)醇類、多糖類、三萜類化合物等[3]。以前文獻(xiàn)多報(bào)道其酚酸類成分[4-7]，但酚酸類物質(zhì)存在于多種中藥材中，特異性不強(qiáng)；近年研究顯示，C21甾體皂苷是通關(guān)藤的主要活性成分，目前從通關(guān)藤藥材中提取的通關(guān)藤苷就超過50種[11-12]。因此，有必要建立以多種通關(guān)藤苷含量為指標(biāo)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本研究在2015年版《中國(guó)藥典》（一部）基礎(chǔ)上，又選擇了含量較高的通關(guān)藤苷A和I[9-10]作為檢測(cè)指標(biāo)。

通關(guān)藤苷A、I屬于甾體皂苷類，是一類苷元為孕甾烷衍生物與2-脫氧糖等形成的苷，在紫外光譜末端有吸收，因此多數(shù)文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道采用 HPLC法對(duì)甾體皂苷類進(jìn)行測(cè)定，但是采用末端吸收波長(zhǎng)會(huì)受到較大干擾；且由于通關(guān)藤苷H沒有紫外吸收，所以不能和其他成分同時(shí)檢測(cè)。另一方面，中藥成分復(fù)雜，采用HPLC法分析干擾較大，為達(dá)到合格的分離度，往往分析時(shí)間很長(zhǎng)（>0.5 h）。本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)，MRM模式，通過對(duì)色譜條件及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，6 min內(nèi)完成了對(duì)通關(guān)藤苷A、H、I的同時(shí)測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，為通關(guān)藤藥材的質(zhì)量控制提供了一定供鑒。

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（收稿日期：2017-07-05 修回日期：2017-09-12）

（編輯：張 靜）