孟永梅 王偉

摘要 目的：尋找慢性心力衰竭（CHF）（Chronic Heart Failure，CHF）氣虛血瘀證及氣陰兩虛證的相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)特征，探討證候發(fā)生發(fā)展機(jī)制的可能生物學(xué)通路。方法：研究設(shè)計(jì)分為CHF氣虛血瘀證、氣陰兩虛證、健康對(duì)照組，利用iTRAQ標(biāo)記定量結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證的相關(guān)表達(dá)差異蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)組學(xué)層面的疾病與證候生物學(xué)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可以在一定層面上揭示證的內(nèi)涵。結(jié)果：與健康對(duì)照組比較，在CHF氣虛血瘀證組表達(dá)差異蛋白質(zhì)有16個(gè)，其中載脂蛋白E、半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白等11個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，維生素D結(jié)合蛋白、胰蛋白酶抑制劑等5個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)；與健康對(duì)照組比較，在CHF氣陰兩虛證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)有15個(gè)，其中補(bǔ)體9、間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關(guān)蛋白等10個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，前血清淀粉樣蛋白P、維生素D結(jié)合蛋白等5個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：蛋白質(zhì)組檢測結(jié)果能夠反映CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)，從而能客觀的評(píng)價(jià)證候特征，為病證結(jié)合的研究開拓了新的視野。

關(guān)鍵詞 慢性心力衰竭；中醫(yī)證候；iTRAQ技術(shù)；蛋白質(zhì)組學(xué)

Abstract Objective：To explore proteomics characteristics of chronic heart failure （CHF） with qi deficiency and blood stasis syndrome and qi and yin deficiency syndrome and possible biological pathways of the mechanism.Methods：This study was designed to divide the participants into CHF with qi deficiency and blood stasis syndrome group，qi and yin deficiency syndrome group，healthy control group.Quantitative iTRAQ marker as a new quantitative proteomics technology combined with tandem mass spectrometry was used to analyze the differential protein expression of CHF with qi deficiency and blood stasis syndrome group and qi and yin deficiency syndrome，which may provide experimental evidence for the disease and biological basis in protein level，and reveal the content of syndrome in a certain level.Results：Compared with healthy control group，a total of 16 kinds of protein had differential expression in qi deficiency and blood stasis group.The expressions of apolipoprotein E，galectin-3-binding protein and other 9 kinds of proteins were up-regulated.The expressions of vitamin D-binding protein （DBP），trypsin inhibitor and other 3 proteins were down-regulated.Compared with health control group，there were 15 kinds of proteins which had differential expressions in qi and yin deficiency group，and complement 9，inter-alpha-trypsin inhibitor family heavy chain-related protein （IHRP） and other 8 proteins expressions were up-regulated.The expressions of pre-serum amyloid P component，DBP and other 3 proteins were down-regulated.Conclusion：Proteomic detection results can reflect the biological basis of CHF qi deficiency and blood stasis syndrome，qi and yin deficiency syndrome factor，which can objectively evaluate characteristics of this syndrome and provide new view of combined research of disease and syndrome.

Key Words Chronic heart failure； Traditional Chinese Medicine syndrome； iTRAQ； Proteomics

中圖分類號(hào)：R2-03文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.004

慢性心力衰竭（CHF）是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿，也是最為主要的死亡原因之一。CHF是目前唯一發(fā)病率仍在顯著上升的心血管疾病，且醫(yī)療費(fèi)用比較高[1]。最新研究結(jié)果表明衰弱的心肌從代償期轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥斊诎l(fā)生的細(xì)胞改變中，發(fā)現(xiàn)RBFox2減少與心肌衰弱之間的功能聯(lián)系[2]。在人群中心力衰竭的發(fā)病率為1.5%～5.6%，65歲以上者達(dá)到7.4%，2年死亡率為37%，6年死亡率為82%，5年存活率與惡性腫瘤相仿?？梢娦牧λソ邍?yán)重影響著患者的生命質(zhì)量和壽命，故心力衰竭的防治一直成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界研究領(lǐng)域中的核心問題。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)今生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重要組成部分，它通過比較生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾，揭示其疾病的病理生理過程具有重要意義。iTRAQ技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）2004年開發(fā)的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技術(shù)，它是建立在iTRAQTM試劑的基礎(chǔ)上，可同時(shí)對(duì)多種樣品進(jìn)行絕對(duì)和相對(duì)定量的研究方法，該項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域[3-6]。該方法具有較好的精確性和可重復(fù)性，故彌補(bǔ)了DIGE及ICAT的不足。迄今為止多數(shù)方法只能進(jìn)行2個(gè)蛋白質(zhì)樣品的同步比較，目前iTRAQ試劑能夠同時(shí)進(jìn)行8個(gè)樣品的標(biāo)記和同步分析比較。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜技術(shù)、軟件分析系統(tǒng)的不斷的發(fā)展和改進(jìn)，iTRAQ技術(shù)很有可能成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的支撐技術(shù)[7]。

蛋白組學(xué)與證候研究的結(jié)合，可以在一定層面上揭示中醫(yī)證候的內(nèi)涵，對(duì)證候的相關(guān)指標(biāo)體系的研究起到了積極的推動(dòng)作用。我們利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證組的相關(guān)表達(dá)差異蛋白，并為蛋白質(zhì)層面的疾病與證候生物學(xué)基礎(chǔ)提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年4月至2010年12月內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科、急診心內(nèi)科、蒙醫(yī)科、體檢中心等收治的慢性心力衰竭患者45例，隨機(jī)分為CHF氣虛血瘀證組，CHF氣陰兩虛證組，健康對(duì)照組，每組15例，性別不限。在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，嚴(yán)格遵循流行病學(xué)的原則，采用橫斷面的調(diào)查方法，采集信息以面訪方式進(jìn)行記錄，歸檔。每5例混合為一個(gè)樣品，每組3個(gè)樣品，共計(jì)9個(gè)樣品。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 1）診斷依據(jù)慢性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)及分期依據(jù)（2007年中國慢性心力衰竭診斷治療指南）；2）證候診斷依據(jù)2002年國家食品與藥品監(jiān)督管理局頒布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，且由3名中醫(yī)醫(yī)師盲診，經(jīng)辨證一致者入選。

1.3 試劑與儀器 臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)（80-1，杰瑞爾）；萬分之一天平（HangPingFA1004，上海）；超聲儀（KQ-250DE）；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（HPX-9082ME，上海博訊）；飛行質(zhì)譜儀（MALDETOF，Bruker）；振蕩器（HY-5型，江蘇省金壇市）；高效液相色譜（HPLC）（島津半制備型HPLC系統(tǒng)流動(dòng)相，A液：10 mM KH2PO4，25% ACN，用H3PO4pH3.0；B液：10 mM KH2PO4，2M KCl，25% CAN，用H3PO4pH3.0，陽離子交換柱：Phenomenex Luna 5u SCX 100A）；制冰機(jī)（SIM-F124，sanyo）；納升級(jí)液相色譜（Nano LC，Proxeon Easy nano-LC，流動(dòng)相A：H2O，0.1%FA，B：ACN，0.1%FA，色譜柱，C18反相色譜微柱（100 mm×75 μm），5 micron）；純水機(jī)（Milli-Q，Millpore）；酶標(biāo)儀（BIO-TEX公司，德國）；高壓滅菌器（Labo Autoclave，sanyo）等。實(shí)驗(yàn)材料包括：Triton X-100（Amersham Bioscience）；BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce）；iTRAQReagent-8 Plex Multi-plex Kit（113-119，121）（Applied Biosystems Foster City，CA 94404 USA，批號(hào)：1006023）；proteoExtract Albumin/IgG Removal Kit Cat.No.122642（Merck）；疏水性C18柱（StrataTM XPalentpending Polymeric Reversed Phase）（phenomenex）；2D QUANT Kit（GE Healthcare）；Triethylammonium bicarbonate buffer（TEAB）（Sigma-Aldrich）；Trypsin Gold，Mass Spectrometry Grade（promega）；Zip TipPipette Tips（Millipore）；TFA（MERCK）；CHCA（BRUKER）；CAN（fisher scientific）；IAM（CALBIOCHEM）。

1.4 方法 1）樣品制備：在患者入院第2天早晨6：00—8：00取被檢者空腹靜脈血5 mL，裝入血清管，4 ℃，3 000 r/min，離心20 min，取上清，分裝至凍存管，-80 ℃保存；2）血清高豐度蛋白的去除；3）樣品沉淀及重溶；4）蛋白烷基化；5）2D QUANT Kit（GE）定量及消化；6）蛋白復(fù)溶及標(biāo)記；7）標(biāo)記肽段混合及SCX分離；8）除鹽及凍干；9）樣品復(fù)溶，MALDI檢測及上樣；10）數(shù)據(jù)庫搜索及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 NCBI homan庫；Mascot軟件。得到質(zhì)譜的wjf、xmi文件格式的數(shù)據(jù)用數(shù)據(jù)庫搜索，軟件提取搜索結(jié)果中匹配肽段的保留時(shí)間、報(bào)告離子的強(qiáng)度等信息進(jìn)行蛋白鑒定及定量。數(shù)據(jù)都遞交至NCBI（homan庫）人數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相應(yīng)的搜索。我們運(yùn)用david（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）對(duì)差異蛋白進(jìn)行富集分析，數(shù)據(jù)分析采用fisher Exact test方法。鑒定到2個(gè)以上來自于同一個(gè)蛋白的肽段，認(rèn)為此蛋白可信，兩兩比值不等于1的肽段認(rèn)為存在差異。我們?cè)诒敬藢?shí)驗(yàn)中選取兩兩比值≥1.2或≤-1.2，且P值<0.05，認(rèn)為二者之間存在顯著差異，正負(fù)值表示該蛋白顯著上調(diào)或顯著下調(diào)。

2 結(jié)果

我們使用iTRAQ技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法對(duì)健康對(duì)照組、CHF氣虛血瘀證組、CHF氣陰兩虛證組的血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，研究設(shè)計(jì)每組15例，每5例混合為一個(gè)樣品，每組3個(gè)樣品，共計(jì)9個(gè)樣品。比較CHF氣虛血瘀證、氣陰兩虛證組分別與健康對(duì)照組比較，找出各組表達(dá)的差異蛋白，具體結(jié)果及詳細(xì)描述如下。

2.1 流行病學(xué)一般資料 30例CHF患者合并疾病情況分析，所有入組CHF病例基礎(chǔ)病因均為冠心病，其中合并高血壓者14例，合并陳舊心梗者7例，合并糖尿病和高血脂者各3例。見表1。

2.2 30例CHF患者性別年齡分布情況 所有入組CHF病例在性別及年齡上比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表2。

2.3 2與健康對(duì)照組比較各組間表達(dá)差異的蛋白質(zhì) 我們選取以119（或121）標(biāo)記的健康對(duì)照組的蛋白質(zhì)作為參照，平行檢測，3次生物學(xué)重復(fù)。那么，3次iTRAQ的結(jié)果如何呢？經(jīng)分析得知，第1組已鑒定的蛋白質(zhì)和表達(dá)差異蛋白質(zhì)分別是387個(gè)和34個(gè)，第2組已鑒定的蛋白質(zhì)和表達(dá)差異蛋白質(zhì)分別是305個(gè)和29個(gè)，第3組已鑒定的蛋白質(zhì)和表達(dá)差異蛋白質(zhì)分別是386個(gè)和36個(gè)。去除冗余，實(shí)際得到58個(gè)蛋白，這58個(gè)蛋白質(zhì)在健康對(duì)照組、CHF氣虛血瘀證、氣陰兩虛證組血清中分別被標(biāo)記了已知的同位素。比較某一蛋白質(zhì)在不同組分之間的表達(dá)差異，我們通過該蛋白在不同標(biāo)記下的峰面積之間的比值來計(jì)算。我們選取兩兩比值≥1.2或≤-1.2，且同時(shí)滿足P<0.05時(shí)，我們認(rèn)為該蛋白在相應(yīng)組中明顯上調(diào)或明顯下調(diào)。

2.4 與健康對(duì)照組比較CHF氣虛血瘀證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì) 選擇以119（或121）標(biāo)記的健康對(duì)照組的蛋白質(zhì)作為參照，保證每一個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)2次并且在3次iTRAQ實(shí)驗(yàn)中至少2次或3次出現(xiàn)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)作為入選標(biāo)準(zhǔn)，共找到CHF氣虛血瘀證表達(dá)差異蛋白質(zhì)16個(gè)，其中11個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)（向上的箭頭），5個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)（向下的箭頭）。具體分析結(jié)果見表3。

2.4 與健康對(duì)照組比較CHF氣陰兩虛證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì) 選擇以119（或121）標(biāo)記的健康對(duì)照組的蛋白質(zhì)作為參照，保證每一個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)2次并且在3次iTRAQ實(shí)驗(yàn)中至少2次或3次出現(xiàn)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)作為入選標(biāo)準(zhǔn)，共找到CHF氣陰兩虛證表達(dá)差異蛋白質(zhì)15個(gè)，其中10個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)（向上的箭頭），5個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)（向下的箭頭）。具體分析結(jié)果見表4。

3 討論

本研究擬通過運(yùn)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證患者血清樣品，比較并歸類血清表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，篩選及可能做為CHF證候特異性標(biāo)志物。對(duì)表達(dá)差異的蛋白進(jìn)行歸類，試圖尋找可能與CHF中醫(yī)證候有關(guān)聯(lián)的生物學(xué)指標(biāo)或群，進(jìn)而為CHF證型規(guī)范化研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望更好的指導(dǎo)臨床。

3.1 與健康對(duì)照組比較CHF氣虛血瘀證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)

3.1.1 表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì) 1）代謝紊亂：物質(zhì)在體內(nèi)的消化、吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)、分解等與生理有關(guān)的代謝過程稱為物質(zhì)代謝。物質(zhì)代謝既有同化作用又有異化作用。提起代謝紊亂CHF氣虛血瘀證組在本實(shí)驗(yàn)中主要涉及到脂質(zhì)代謝紊亂及透明質(zhì)酸代謝異常。前者主要包括載脂蛋白E、載脂蛋白D前體，而后者主要包括ITIH1、IHRP。眾所周知，脂類向身體各部位的運(yùn)輸是靠脂蛋白（Lipoproteins）來完成的。血漿中的各類脂蛋白都由蛋白質(zhì)和脂類兩部分組成，其蛋白質(zhì)部分主要為載脂蛋白（Apolipoprotein，apo）。目前發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白有20種之多，主要有apoA、apoB、apoC、apoD、apoE、apoJ等類型。主要在肝（部分在小腸）合成，載脂蛋白是運(yùn)載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)等功能。載脂蛋白D（Apolipoprotein D，apoD）是一個(gè)29 kD的糖蛋白，它最初是在人血漿的高密度脂蛋白中被分離出來的。apoD在結(jié)構(gòu)上與其他類型的載脂蛋白存在很大的差異，被歸入脂肪促成素家族。apoD可以與膽固醇、黃體酮、膽紅素等多種疏水性小分子結(jié)合，另外，apoD在多種脊椎動(dòng)物的各類組織中廣泛表達(dá)，提示apoD在脊椎動(dòng)物中重要的生理功能。近來研究表明，apoD可作為多種癌癥及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的早期診斷標(biāo)記物而備受關(guān)注[8]。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)CHF氣虛血瘀證組有載脂蛋白D前體，并且表達(dá)上調(diào)，可能說明CHF氣虛血瘀證有脂類代謝的變化。除此之外還有ApoE，它是存在于多種脂蛋白顆粒中，是正常人血漿脂蛋白中重要的載脂蛋白成分，主要功能為運(yùn)輸并介導(dǎo)某些脂蛋白與相應(yīng)的受體。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ApoE參與磷脂及膽固醇的動(dòng)員和再分布，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、維持膽固醇平衡，同時(shí)還參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷后的修復(fù)過程。ApoE主要由肝臟產(chǎn)生，還有腦、脾、腎上腺等組織和單核巨噬細(xì)胞也合成ApoE（約為總量的10%～20%）[9]。另有文獻(xiàn)指出ApoE可作為肝細(xì)胞癌HCC的一個(gè)組織學(xué)標(biāo)記物[10]。間α胰蛋白酶抑制劑（Interatrypsininhibitor，ITI）家族是在人和動(dòng)物的血液中存在的一種蛋白質(zhì)[11]，ITI包括ITIH1，ITIH2，ITIH3，ITIH4和ITIH5，以及輕鏈bikunin。Bour-guignon對(duì)人類健康肺組織和惡性組織中ITI輕鏈和重鏈進(jìn)行免疫組化觀察，發(fā)現(xiàn)不但I(xiàn)TI輕鏈與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，ITI重鏈也與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的此類蛋白質(zhì)有間-α胰蛋白酶抑制劑重鏈（ITIH1）、α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關(guān)蛋白（IHRP）在CHF氣虛血瘀證組均上調(diào)。ITI家族所有成員在惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中均起著不同的重要作用[13]。2）補(bǔ)體相關(guān)：補(bǔ)體是存在于正常人和動(dòng)物血清與組織液中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。主要承擔(dān)機(jī)體調(diào)節(jié)、免疫、炎性反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能。本實(shí)驗(yàn)中CHF氣虛血瘀證組與補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)有C9、補(bǔ)體C5前蛋白原，且在CHF氣虛血瘀證組的表達(dá)均上調(diào)。有研究證明腦出血后補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激活C9高表達(dá)并有沉積[14-15]。另有研究指出，與良性卵巢腫瘤比較，在卵巢上皮性癌中，銅藍(lán)蛋白、C9蛋白表達(dá)上調(diào)[16]。3）免疫相關(guān)：α-2巨球蛋白前體（Alpha-2-macroglobulin precursor）為α-2巨球蛋白的前體物質(zhì)。α-2巨球蛋白是血漿中一種主要的四聚體糖蛋白，是由肝細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中合成，是所有已知內(nèi)蛋白酶的循環(huán)性抑制劑。對(duì)人體許多病理、生理過程發(fā)揮重要作用[17]。它與淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和功能有密切聯(lián)系。該蛋白在CHF的氣虛血瘀證組中表達(dá)上調(diào)。4）炎性反應(yīng)相關(guān)：與炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)主要是血清淀粉樣蛋白A-4蛋白前體（SAA4）。我們知曉血清淀粉樣蛋白A（Serum Amyloid A，SAA）通常被認(rèn)為是炎性反應(yīng)的主要蛋白之一，SAA家族有4個(gè)成員，分別按被發(fā)現(xiàn)的順序命名為SAA1、2、3、4，最近越來越多的報(bào)道SAA參與了多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。5）細(xì)胞凋亡相關(guān)：半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白（Galectin-3-binding Protein）為一種β半乳糖苷結(jié)合的凝集素，是脊椎動(dòng)物半乳糖凝集素家族中的一種亞型，相對(duì)分子質(zhì)量為31 000，它可通過與配體的反應(yīng)發(fā)揮很多生物學(xué)效應(yīng)。半乳糖凝集素3在活化的嗜堿性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及一些感覺神經(jīng)元中表達(dá)最多。它主要存在于細(xì)胞漿中，尚可存在于細(xì)胞核、表面或胞外[19]?，F(xiàn)已證實(shí)半乳糖凝集素3在許多上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中有表達(dá)且參與多種細(xì)胞功能，尤其在mRNA剪接過程中發(fā)揮重要的作用，它還參與細(xì)胞生長，免疫調(diào)節(jié)等。有一項(xiàng)研究證明，惡性腫瘤中半乳糖凝集素3表達(dá)增高可能與它刺激細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)中半乳糖凝集素-3-結(jié)合蛋白在CHF在氣虛血瘀證組表達(dá)上調(diào)。6）無名蛋白質(zhì)：發(fā)現(xiàn)2個(gè)NCBI庫中無名蛋白質(zhì)分別為gi|37138和gi|16553735，前者13個(gè)肽段被標(biāo)記，后者2個(gè)肽段被標(biāo)記。

3.1.2 表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì) 1）代謝相關(guān)：代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)主要有胰蛋白酶抑制劑、TBPA、載脂蛋白C-Ⅲ前體，下面逐一探討。胰蛋白酶抑制劑（Trypsin Inhibitor），它抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，從而阻止胰腺中其他活性蛋白酶原的激活及其他的自身激活。本次實(shí)驗(yàn)中CHF氣虛血瘀證組該蛋白表達(dá)下調(diào)。TBPA是甲狀腺素運(yùn)載蛋白的前體物質(zhì)，有報(bào)道稱，肺淀粉樣病變的淀粉樣物的來源主要來自血漿甲狀腺素運(yùn)載蛋白。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較該蛋白在CHF氣虛血瘀證組下調(diào)。我們曉得載脂蛋白C是目前所知載脂蛋白中分子量最小的一類，在本實(shí)驗(yàn)中與健康對(duì)照組比較CHF氣虛血瘀證組ApoCⅢ前體下調(diào)。50年代Shore等分別報(bào)道，VLDL中ApoA和B外，還有第3種載脂蛋白。2）免疫相關(guān)：DBP是一種具有多種功能的蛋白質(zhì)，主要參與維生素D的轉(zhuǎn)運(yùn)和清除肌動(dòng)蛋白，并具有免疫調(diào)節(jié)作用[21]。本實(shí)驗(yàn)中CHF氣虛血瘀證組表達(dá)下調(diào)。3）炎性反應(yīng)相關(guān)：我們知道炎性反應(yīng)在冠心病發(fā)病過程中的作用，但是炎性反應(yīng)是否參與CHF的形成機(jī)制呢？我們?cè)贑HF組中發(fā)現(xiàn)銅藍(lán)蛋白前體（Ceruloplasmin Precursor），是銅藍(lán)蛋白（CP/CER）的前體物質(zhì)。CP是血清中的含銅蛋白質(zhì)，結(jié)合6或7個(gè)銅離子，亮藍(lán)色，在銅解毒和貯存以及鐵代謝中起重要作用，有可能參與清除氧自由基和超氧陰離子。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較該蛋白在CHF氣虛血瘀證組表達(dá)下調(diào)。

3.2 與健康對(duì)照組比較CHF氣陰兩虛證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)

3.2.1 表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì) 與健康對(duì)照組比較，CHF氣陰兩虛證組表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有C 9、IHRP、α-2巨球蛋白前體、ITIH1、SAA4前體、胰蛋白酶抑制劑、TBPA、補(bǔ)體C5前蛋白原、ApoC-II和gi|16553735，以上10個(gè)蛋白在前面均已敘述過，在此省略。

3.2.2 表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì) 與健康對(duì)照組比較，CHF氣陰兩虛證組表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)有DBP、銅藍(lán)蛋白前體、半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白、前血清淀粉樣蛋白P（Pre-serum Amyloid P Component，SAP）、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)（Immunoglobulin Heavy Chain Variable Region，IgVH），其中前3者均已在前面敘述過，下面主要詳細(xì)探討后兩者蛋白質(zhì)。

SAP是一種非纖維血漿糖蛋白，屬于pentraxin家庭，系由肝臟合成的糖蛋白，廣泛存在于所有脊椎動(dòng)物的血液中，人血清中的含量約為30～50 mg/L，它由10個(gè)相同的分子量均為25KD的亞基組成，亞基間通過非共價(jià)鍵連接而成2個(gè)完全相同的環(huán)狀平行五聚體蛋白質(zhì)[22-23]。SAP通過Ca2+依賴性方式與多種配體結(jié)合，包括纖連蛋白、黏多糖、C4b結(jié)合蛋白、補(bǔ)體成分、聚合IgG、C反應(yīng)蛋白（CRP）、淀粉樣原纖維、膠原蛋白等。SAP可能通過激活并調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)干擾脂蛋白代謝，參與淀粉樣蛋白的形成[24]。張鳳珍等報(bào)道稱[25]，血漿HDL的生理功能是完成膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，將肝外組織膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝內(nèi)轉(zhuǎn)化排泄，故HDL有利于降低血膽固醇，將其視為有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。VLDL可將肝內(nèi)合成的內(nèi)源性TG轉(zhuǎn)運(yùn)出肝到外周組織，經(jīng)LPL催化降解為脂肪酸和甘油。LDL將肝內(nèi)合成內(nèi)源性膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到外周組織，故將其視為致動(dòng)脈粥樣硬化因子。人血清中，SAP與HDL呈負(fù)相關(guān)，與VLDL呈正相關(guān)。SAP與血漿HDL、VLDL結(jié)合，具有較高親和力，而不與LDL結(jié)合。研究還顯示，SAP的功能與連接脂蛋白相互作用的能力相關(guān)，特別在動(dòng)脈粥樣硬化和淀粉樣病變的發(fā)病機(jī)制中起了重要作用。還發(fā)現(xiàn)，它有助于保持淀粉樣蛋白沉積的穩(wěn)定。與健康對(duì)照組比較SAP在CHF氣陰兩虛證組表達(dá)下調(diào)，說明有脂類代謝的變化。

免疫球蛋白重鏈可變區(qū)（IgVH），重鏈大小約為輕鏈的2倍。根據(jù)H鏈抗原性的差異將其分為5類：μ、γ、α、δ和ε鏈，不同H鏈和L鏈（κ或λ鏈）組成完整Ig的分子分別稱之為IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ鏈上含有4個(gè)肽，μ和ε鏈含有5個(gè)環(huán)肽。Ig是體液免疫應(yīng)答中，免疫功能最重要的免疫分子。該蛋白質(zhì)在CHF氣陰兩虛證組表達(dá)下調(diào)。

總之，利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測結(jié)果在一定程度上能夠反映CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)，可能更客觀的評(píng)價(jià)證候特征，有可能為CHF證候的診治提供新的血清標(biāo)志物。但是，機(jī)體是一個(gè)完整的、相互聯(lián)系的復(fù)雜體系，而證候則是對(duì)機(jī)體在疾病某一階段的整體狀態(tài)的反應(yīng)。因此，很難簡單地用一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)的變化來囊括此狀態(tài)。某一個(gè)蛋白質(zhì)的上調(diào)或下調(diào)往往會(huì)影響上下游幾個(gè)蛋白的表達(dá)狀態(tài)。需要從“同病異證”和“異病同證”的蛋白表達(dá)譜差異中尋找證候的共同性和差異性，從而揭示證候的科學(xué)內(nèi)涵。故，我們?cè)趯淼难芯恐?，更?yīng)該深入研究，在中醫(yī)證候?qū)W領(lǐng)域進(jìn)行更廣、更深的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]陳瑩，金艷蓉，楊海燕.慢性心力衰竭康復(fù)治療研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2015，13（1）：25-27.

[2]Wei C，Qiu J，Zhou Y，et al.Repression of the Central Splicing Regulator RBFox2 Is Functionally Linked to Pressure Overload-Induced HeartFailure[J].Cell Reports，2015，10（9）：1521-1533.

[3]曹美群，吳正治，吳偉康.應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)篩選白厚苔和黃厚苔乳腺癌患者唾液差異表達(dá)蛋白[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2011，9（3）：275-280.

[4]王黎熔，王靜，王富強(qiáng)，等.iTRAQ技術(shù)鑒定小鼠睪丸發(fā)育差異表達(dá)蛋白的研究[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2010，28（6）：441-443.

[5]魏哲，水稻對(duì)褐飛虱取食應(yīng)答的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].武漢：武漢大學(xué)，2010.

[6]龐秋穎，鹽脅迫鹽芥和擬南芥的芥子油苷和蛋白質(zhì)組比較[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2010.

[7]韓額爾德木圖，孟永梅.iTRAQ多重化學(xué)標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016（4）：795-798.

[8]王磊，宿紅艷，明永飛，等.載脂蛋白D的結(jié)構(gòu)、功能及臨床應(yīng)用[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2008，30（1）：50-54.

[9]陳曉紅，王蔭華.載脂蛋白E-Alzheimer病的危險(xiǎn)因子[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2002，8（7）：411-413.

[10]Yokoyama Y，Kuramitsu Y，Takashima M，et al.Protein level of apolipoprotein E increased in human hepatocellular carcinoma[J].Int J Oncol，2006，28（3）：625-631.

[11]趙明，米田雅彥，術(shù)全弘治.間α胰蛋白酶抑制劑與胞外間質(zhì)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)進(jìn)展，1997，24（3）：220-223.

[12]和桂琴，梁建芳，鄭繪霞，等.間α胰蛋白酶抑制劑重鏈H4在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及意義[J].中國藥物與臨床，2010，10（4）：422-424.

[13]Alexander H，Juergen V，Nuran B，et al.Frequent expression loss of Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain（ITIH）genes in multiple human solid tumors：a systematic expression analysis[J].BMC Cancer，2008，8（1）：25.

[14]馬領(lǐng)松，周向陽，費(fèi)世早，等.補(bǔ)體介導(dǎo)出血性腦損傷機(jī)制及CVF干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24（4）：253-257.

[15]劉兵榮，肖瑾，丁新生.大鼠腦出血后血腫周圍補(bǔ)體C9和核因子-κB65表達(dá)及黃芪多糖的干預(yù)作用[J].中國腦血管病雜志，2007，4（1）：26-31.

[16]欒曉蕊，張婷，吳霞，等.利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測卵巢上皮性癌血清標(biāo)記物的研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2010，19（7）：510-513.

[17]孫英，李仁忠，張宗玉，等.α-2巨球蛋白在人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞衰老過程中的作用[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2005，24（11）：858-861.

[18]周敏，歐陽建，富田毅，等.人血清淀粉樣蛋白A家族在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制的初步研究[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17（21）：1701-1704.

[19]Yoshii T，Inohara H，Takenaka Y，et al.Galectin-3 maintains the transformed phenotype of thyroid papillary carcinoma cells[J].International Journal of Oncology，2001，18（4）：787.

[20]張延美，蔣玲，曲衛(wèi)，等.半乳糖凝集素3表達(dá)在良惡性甲狀腺腫瘤鑒別中的意義[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2005，21（2）：121-125.

[21]張劍文，劉煒，傅斌生，等.乙腈預(yù)處理血清尋找肝細(xì)胞癌發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2010，31（2）：288-292.

[22]龐呈義，李祥安，馬培珍，等.人血清淀粉樣蛋白P的分離、純化及抗血清的制備[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，19（3）：189-191.

[23]Emsley J，White HE，O′Hara BP，et al.Structure of pentameric human serum amloid P com-ponent[J].Nature，1994，367（6461）：338-345.

[24]Ying SH，Gewuiz AT，Jiang H，et al.Human serum amyloid Pcomponent oligomers bind and activate the classical componentpathway via residues 14-26 and 76-92 of the chain collagen-likeregion of Clq[J].J Immunol，1993（150）：169-176.

[25]張鳳珍，郝岡平，孫凌云，等.血清淀粉樣蛋白P與血漿脂蛋白作用機(jī)制的研究[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，24（4）：333-336.

（2018-08-18收稿 責(zé)任編輯：張文婷）