袁水娟, 施國(guó)君, 唐慧青, 施美蓮

(1. 上海交通大學(xué), 上海 200240; 2. 上海靈暢生物科技有限公司, 上海 201402;3. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司, 上海 201615)

嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠是一種先天性淋巴細(xì)胞免疫缺陷動(dòng)物，純合的SCID基因特異性地阻礙了T和B淋巴細(xì)胞分化，使動(dòng)物缺乏功能性的T和B淋巴細(xì)胞。它是Bosman等[1]于1983年在CB17近交系小鼠中發(fā)現(xiàn)的，比單純的T細(xì)胞缺乏的裸小鼠在腫瘤免疫研究方面更具有優(yōu)越性，是研究腫瘤、免疫、病原體感染、生殖等方面極好的材料和動(dòng)物模型。

鑒于SCID小鼠從國(guó)外引進(jìn)以來(lái)，由于飼養(yǎng)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)水平等與國(guó)外都有差異，這些因素都可能導(dǎo)致小鼠的遺傳性狀、生理生化等生物學(xué)特性發(fā)生改變。本文針對(duì)本公司飼養(yǎng)的SCID小鼠，測(cè)定了其主要臟器重量、血生理生化、免疫球蛋白、補(bǔ)體和免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)，為利用該品系進(jìn)行生物醫(yī)藥、腫瘤學(xué)等方面研究者提供基礎(chǔ)的生物學(xué)數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源

在上海靈暢生物科技有限公司 [SCXK(滬)2013-0018] SPF級(jí)SCID小鼠第三代生產(chǎn)群中隨機(jī)抽取4周齡、8周齡、16周齡各20只(雌雄各半)用于動(dòng)物臟器質(zhì)量、血液生理生化、免疫蛋白和補(bǔ)體數(shù)據(jù)測(cè)定;隨機(jī)抽取8周齡20只(雌雄各半)用于免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)測(cè)定。選取的動(dòng)物采取隨機(jī)方式, 未進(jìn)行滲漏檢測(cè)。

1.2 環(huán)境及飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用小鼠飼養(yǎng)在上海靈暢生物科技有限公司隔離中，隔離器內(nèi)的空氣為100級(jí)全新風(fēng), 室內(nèi)溫度 22～26 ℃, 相對(duì)濕度為 40%～60%, 換氣次數(shù)每小時(shí)20次, 光照明暗各12 h∶12 h, 動(dòng)物自由采食。

小鼠用飼料、墊料為上海普路騰生物科技有限公司提供[滬飼證(2014)04001]，經(jīng)35 kGy60Co輻照，飼料的營(yíng)養(yǎng)成分為: 粗蛋白24.5%～25.5%，粗脂肪5.5%～6.5%，粗灰分6.0%～6.5%，粗纖維4.0%～4.5%，水份≤10%，鈣1.2%～1.5%，磷0.75%～1.0%，賴氨酸≥1.32%，蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。飲用水為酸化過(guò)濾純水，pH值為2.5～3.5，并經(jīng)121℃、40 min高壓蒸汽滅菌。墊料每周更換一次, 進(jìn)出隔離器的物品均進(jìn)行121 ℃,30 min消毒滅菌處理。

1.3 主要儀器

日立7020全自動(dòng)生化分析儀、Eppendorf 5427R離心機(jī)、美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀、Mettler toledo AL104電子稱[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，可讀性0.0001 g]; 手術(shù)剪、眼科鑷等常規(guī)手術(shù)器械。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 臟器質(zhì)量的測(cè)定 電子天平稱體質(zhì)量后, 按動(dòng)物體質(zhì)量30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉, 眼眶靜脈采血后, 脫頸椎施行安死術(shù)。立即剖取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦、睪丸、卵巢, 并用濾紙吸干組織表面水分, 稱取臟器重量。

1.4.2 血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定 取 20 μL全血加 500 μL稀釋液混勻, 用Sysmex KX-21N全自動(dòng)血球分析儀檢測(cè), 指標(biāo)為白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、紅細(xì)胞體積分布寬度(R D W)、血小板平均容積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)、淋巴細(xì)胞(LYM)、血小板大細(xì)胞比率(P-LCR)。

1.4.3 血液生化、免疫球蛋白和補(bǔ)體指標(biāo)測(cè)定 取0.8 mL全血置離心管內(nèi)，4 ℃冰箱內(nèi)放置1 h后2 800× g離心10 min, 分離出血清，進(jìn)行血液生化、免疫球蛋白、補(bǔ)體的測(cè)定。血液生化指標(biāo)為總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總尿素氨(BUN)、鈣(Ca)、磷(P)。免疫球蛋白和補(bǔ)體指標(biāo)為IgG、IgA、IgM、C3、C4。

1.4.4 免疫細(xì)胞測(cè)定 動(dòng)物處死后取脾臟，盡量去除附著其上的脂肪組織，放入淋巴細(xì)胞分離液，研磨，將分離液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，覆蓋200～500 μL的1640培養(yǎng)基, 800 ×g離心30 min, 吸出淋巴細(xì)胞層, 再加入10 mL 1640培養(yǎng)基, 250 ×g離心10 min收集細(xì)胞，傾倒上清液，流式細(xì)胞儀細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定T細(xì)胞及亞群、B細(xì)胞(B220+)、NK細(xì)胞(NK1.1+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用軟件SPSS 19.0單因素方差分析分析, 數(shù)值以表示, P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCID小鼠臟器質(zhì)量

從表1可見(jiàn), 4周齡SCID小鼠不同性別間心臟、肺臟、脾臟、腦、腎上腺、胸腺質(zhì)量差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4周齡SCID小鼠的心臟、肺臟、肝臟、腎臟重量均顯著小于8周齡和16周齡小鼠。SCID小鼠的胸腺重量與性別、周齡均無(wú)關(guān)，各數(shù)據(jù)間無(wú)顯著差異。在8周齡時(shí), SCID小鼠雌性和雄性的脾臟最小, 性別間存在顯著性差異。

表1 SCID小鼠臟器質(zhì)量 mg

2.2 SCID小鼠血液生理指標(biāo)

從表2可見(jiàn)，4周齡不同性別的SCID小鼠WBC，RDW-CV含量無(wú)顯著差異，而8周齡、16周齡在不同性別間有顯著差異。4周齡、8周齡、16周齡的SCID雌鼠MCH水平均顯著高于雄鼠。不同周齡SCID小鼠RBC、LYM含量，8周齡數(shù)值最低, 8周齡、16周齡均顯著低于4周齡。不同周齡不同性別的SCID小鼠在PLT、RDW-SD水平上無(wú)顯著差異。4周齡的SCID雌性、雄性鼠的PDW、MPV顯著低于8周齡和16周齡的小鼠。

2.3 SCID小鼠血液生化指標(biāo)

從表3可見(jiàn), 16周齡SCID雌性、雄性小鼠TG水平均顯著低于4周齡、8周齡雌性、雄性小鼠。8周齡、16周齡的SCID雌鼠LDL-C、ALP水平均顯著高于雄鼠, 而GLU顯著低于雄鼠。SCID雌性、雄性小鼠的Ca、P指標(biāo)隨著周齡增長(zhǎng)逐步降低趨勢(shì)。

表2 SCID小鼠血液生理指標(biāo)

表3 SCID小鼠血液生化指標(biāo)

2.4 SCID小鼠主要免疫球蛋白、補(bǔ)體指標(biāo)

從表4可見(jiàn)，4周齡SCID小鼠的IgG、IgA、IgM水平顯著大于8周齡、16周齡的SCID的小鼠 。8周齡的SCID小鼠5項(xiàng)指標(biāo)無(wú)性別上差異，而16周齡的SCID小鼠5項(xiàng)雄性顯著高于雌性。

2.5 SCID小鼠主要免疫細(xì)胞指標(biāo)

CD3+在整體免疫細(xì)胞占比最小，而B(niǎo)220+占比最大。在性別上，T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞無(wú)顯著差異(表5)。

表4 SCID小鼠主要免疫球蛋白、補(bǔ)體指標(biāo)

表5 SCID小鼠主要免疫細(xì)胞 %

3 討論

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官,其在一定程度上可以反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。本文數(shù)據(jù)顯示，SCID小鼠胸腺質(zhì)量是隨著周齡的上升也處于上升狀態(tài), 但不存在顯著性差異, 說(shuō)明小鼠胸腺的發(fā)育并不像正常非免疫缺陷小鼠那樣出生后快速生長(zhǎng)，性成熟達(dá)到高峰，以后逐漸退化萎縮，和國(guó)內(nèi)學(xué)者的數(shù)據(jù)相符[2]。16周齡SCID小鼠胸腺這一免疫器官質(zhì)量并沒(méi)有萎縮, 可能說(shuō)明SCID小鼠隨著周齡的增大, 免疫能力也在逐步地恢復(fù)，因而實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)滲漏現(xiàn)象[3]。8周齡的SCID小鼠雌性和雄性的脾臟質(zhì)量最小，這提示在免疫學(xué)研究時(shí)要盡量使用8周齡左右的SCID小鼠。據(jù)資料顯示[4]，SCID小鼠6～8周齡的免疫滲漏率為5.5%, 17～19周齡為26.7%。

本實(shí)驗(yàn)SCID小鼠生理結(jié)果與Charles River公司公布的2011年1～12月的8～10周齡的SCID小鼠數(shù)據(jù)基本相符，SCID小鼠生化數(shù)據(jù)中ALT、GLU偏低, 可能與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)有關(guān)。自1981年Siegel等[5]提出的“紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)”概念，隨后許多學(xué)者對(duì)紅細(xì)胞免疫功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，表明它與白細(xì)胞都參與了免疫系統(tǒng)，兩者都具有多種免疫功能[6]。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCID小鼠WBC和RBC的含量隨著周齡增加而增加可能是SCID小鼠的滲漏現(xiàn)象使部分免疫細(xì)胞得以恢復(fù)，免疫功能增強(qiáng)，其自身的免疫缺陷隨著周齡的增加而自我恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SCID小鼠在RBC、LYM水平上，8周齡數(shù)值最低，8周齡、16周齡均顯著低于4周齡，也表明在8周齡時(shí)SCID小鼠免疫功能最為低下。本文測(cè)定的3個(gè)周齡段SCID小鼠免疫球蛋白和補(bǔ)體與免疫功能正常小鼠相比，其抗體含量IgG、IgA、IgM水平均遠(yuǎn)低于正常小鼠的水平[7]，也證實(shí)SCID小鼠屬于T、B細(xì)胞免疫缺陷動(dòng)物。

脾臟是機(jī)體最大外周免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心, 其中T淋巴細(xì)胞占35%～50%，B淋巴細(xì)胞占50%～65%。本文通過(guò)對(duì)SCID小鼠脾臟免疫細(xì)胞測(cè)定，顯示在脾臟淋巴細(xì)胞中SCID小鼠T細(xì)胞含量最低，有活性的CD3+、CD4+、CD8+百分比含量很低，B細(xì)胞百分比含量最高，活性最高。此結(jié)果與外周血免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比[8], 脾臟細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中CD3+、B220+、NK1.1+明顯高于外周血的百分比含量，表明這些免疫細(xì)胞在脾細(xì)胞中百分比含量更高，尤其B細(xì)胞更為突出。

SCID小鼠作為T(mén)、B細(xì)胞免疫缺陷動(dòng)物模型，目前在生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域和人類腫瘤移植方面使用非常廣泛。本文通過(guò)對(duì)SCID小鼠主要臟器質(zhì)量、血液生理生化、免疫球蛋白、補(bǔ)體及免疫細(xì)胞的測(cè)定與分析，可以為生產(chǎn)和研究單位更好地了解SCID小鼠的基礎(chǔ)生物學(xué)特性數(shù)據(jù)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的生理生化數(shù)據(jù)與國(guó)外SCID小鼠數(shù)據(jù)基本符合，也表明該品系自引種以來(lái)未發(fā)生生物學(xué)特性的明顯改變。