黎 民, 常學(xué)輝, 張良芝, 雷 震, 羅 申

(1. 周口市中醫(yī)院, 周口 466000; 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué), 鄭州 450002;3. 河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室, 鄭州450002)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中、老年人常見的運(yùn)動障礙性疾病，是一種以中腦黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性缺失，伴胞質(zhì)內(nèi)Lewy小體形成為特征性改變的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，鑒于其確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚[1,2]，PD基礎(chǔ)研究目前仍是國內(nèi)外神經(jīng)病學(xué)專家關(guān)注的重點(diǎn)。

6-羥基多巴胺(6-OHDA)建立的PD大鼠模型因造價(jià)低、方法簡單、模型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于PD的基礎(chǔ)研究[3]。目前PD大鼠模型成功率差別較大，原因在于建立PD大鼠模型的影響因素較多，其難點(diǎn)在于注射位點(diǎn)及6-OHDA注射劑量的選擇。在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇應(yīng)用最多的注射位點(diǎn): 中腦黑質(zhì)致密區(qū)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)及紋狀體，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，探索一種更為理想的PD大鼠模型建立方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠76只, 體質(zhì)量180～220 g,購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(晉)2015-0001]。飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)[許可證號: (2014)01008], 墊料為玉米芯。實(shí)驗(yàn)在河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK(豫)2011-0002]進(jìn)行, 飼養(yǎng)于大鼠IVC, 明暗交替12 h∶12 h,溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后, 無不良反應(yīng), 開始實(shí)驗(yàn), 并按實(shí)驗(yàn)動物使用3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

6-OHDA，維生素C(AR，99%), 購自上海源葉生物科技有限公司, 鹽酸阿樸嗎啡, 購自中國藥品檢定研究院, 絡(luò)氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase, TH)抗體購自美國 Cell Signaling公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

大鼠腦立體定位儀(美國Stoelting公司)，電動顱骨鉆(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，大鼠IVC(馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司)，電子精密天平(德國賽多利斯公司)。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將76只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組, 其中中腦單點(diǎn)組22只、中腦雙點(diǎn)組22只、紋狀體單點(diǎn)雙注組22只、對照組10只, 使用大鼠腦立體定位儀定位, 參照文獻(xiàn)[4]方法,按照分組情況建立PD大鼠模型。(1) 中腦單點(diǎn)組: 中腦黑質(zhì)致密部(SNC)單點(diǎn)坐標(biāo)A/P(距前囟中心后):-5.0 mm、L/R(距前囟中心左右): -1.7 mm、O/V(距腦膜表面深度): -7.6 mm; 單點(diǎn)注入6-OHDA溶液(2 mg/mL) 12 mL。(2)中腦雙點(diǎn)組: 中腦黑質(zhì)致密部A/P: -5.0 mm、L/R: -1.7 mm、O/V: -7.6 mm; 中腦腹側(cè)被蓋區(qū)A/P: -4.6 mm、L/R: -0.9 mm、O/V:-7.3 mm; 每點(diǎn)注入6-OHDA溶液(2 mg/mL) 6 mL。(3) 紋狀體單點(diǎn)雙注組: 紋狀體單點(diǎn)雙注A/P: -1.0 mm、L/R: -2.7 mm、O/V: -5.2 mm和O/V: -6.0 mm; 單點(diǎn)注入6-OHDA溶液(2 mg/mL) 12 mL，分2次注射。(4) 對照組: 中腦黑質(zhì)致密部(SNC)單點(diǎn)坐標(biāo)A/P:-5.0 mm、L/R: -1.7 mm、O/V: -7.6 mm; 單點(diǎn)注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%維生素C溶液12 mL。

分別在造模后1周、2周、4周、8周腹腔注射誘導(dǎo)劑APO 0.5 mg/kg, 誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn), 注射后觀察大鼠行為學(xué)變化并記錄其30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)。若大鼠恒定向健側(cè)旋轉(zhuǎn)且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥7 r/min,則為造模成功; 若大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＜7 r/min或者15 min內(nèi)無旋轉(zhuǎn)，則為造模失敗。

1.4.2 取材與指標(biāo)檢測 各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，注射后8周行為學(xué)檢測完畢后，將所有大鼠腹主動脈取血后斷頭取腦，在冰盤上快速完整剝離腦組織，生理鹽水清洗后放入體積分?jǐn)?shù)10%多聚甲醛中4 ℃固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，切片(厚5 μm)。按照試劑盒說明書進(jìn)行HE染色和酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學(xué)染色; 利用Leica顯微照相系統(tǒng)和Biosens Digital Imaging System圖像采集系統(tǒng)對TH免疫組織化學(xué)染色圖像(細(xì)胞質(zhì)棕褐色為陽性細(xì)胞)進(jìn)行分析, 先用低倍鏡選擇陽性表達(dá)的區(qū)域, 再利用高倍鏡(400×)在切片的同一區(qū)域, 隨意選擇5個(gè)視野, 收集5組數(shù)據(jù), 其平均值則為平均積分光密度(Integrated optical density, IOD), 其值表示指標(biāo)表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，造模成功率用%表示，大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)及TH免疫組化陽性細(xì)胞IOD值以表示，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性的采用單因素方差分析，如不符合正態(tài)分布和方差齊性則采用多個(gè)相關(guān)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠模型行為學(xué)檢測

造模后3 d內(nèi)中腦雙點(diǎn)組大鼠死亡2只，紋狀體單點(diǎn)雙注組死亡1只，對照組死亡2只，最終中腦單點(diǎn)組22只，中腦雙點(diǎn)組20只，紋狀體單點(diǎn)雙注組21只，對照組8只大鼠進(jìn)入統(tǒng)計(jì)結(jié)果。典型PD大鼠模型在注射APO后數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)即可出現(xiàn)向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)行為，以左后肢為支撐點(diǎn)，頭尾相連，身體約成環(huán)形，原地旋轉(zhuǎn)，時(shí)有嗅探、覓食及弓背等動作。

造模1周時(shí)經(jīng)APO誘導(dǎo)，中腦單點(diǎn)組造模成功13只，中腦雙點(diǎn)組成功9只，紋狀體單點(diǎn)雙注組成功7只，對照組大鼠無旋轉(zhuǎn)行為(表1)，各周及最終各組造模成功率詳見表1，各組間造模成功率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

中腦單點(diǎn)組經(jīng)APO誘導(dǎo)，1周時(shí)PD模型大鼠平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為(7.3±0.2) r/min，其后逐漸增加；中腦雙點(diǎn)組和紋狀體單點(diǎn)雙注組平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)亦有相似的變化趨勢，相同時(shí)間點(diǎn)各組間平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見表2。

2.2 大鼠模型損毀側(cè)TH免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞IOD值

中腦單點(diǎn)組、中腦雙點(diǎn)組及紋狀體單點(diǎn)雙注組大鼠損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞IOD明顯比對照組小(P＜0.01); 中腦單點(diǎn)組大鼠損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞IOD比中腦雙點(diǎn)組及紋狀體單點(diǎn)雙注組小(P＜0.05); 中腦雙點(diǎn)組大鼠損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞IOD比紋狀體單點(diǎn)雙注組小(P＜0.05)(表3)。

表1 PD大鼠造模成功率 n(%)

表2 PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為變化 r/min

表3 PD大鼠損毀側(cè)TH免疫組化陽性細(xì)胞IOD值

2.3 病理學(xué)觀察

2.3.1 損毀側(cè)HE染色 對照組大鼠神經(jīng)元相對密集, 排列整齊, 胞漿豐富, 未見皺縮, 胞核居中(圖1A);紋狀體單點(diǎn)雙注組和中腦雙點(diǎn)組成功PD大鼠的神經(jīng)元變性、壞死，細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞空泡變性, 殘留細(xì)胞皺縮, 排列散亂(圖1B、圖1C); 中腦單點(diǎn)組成功PD大鼠的神經(jīng)元大量變性、壞死，細(xì)胞數(shù)量明顯減少, 散在分布, 殘留細(xì)胞皺縮(圖1D)。

2.3.2 損毀側(cè)TH免疫組織化學(xué)染色 對照組大鼠損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)量較多，胞體較大突起較為明顯(圖2A); 紋狀體單點(diǎn)雙注組、中腦雙點(diǎn)組及中腦單點(diǎn)組成功PD大鼠損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少，散在分布，而中腦單點(diǎn)組TH陽性細(xì)胞數(shù)最少(圖2B、C、D)。

3 討論

Ungerstedt[5]于1968年首次報(bào)道了采用6-OHDA建立PD大鼠模型，認(rèn)為動物旋轉(zhuǎn)模型的某些特點(diǎn)與人類PD相似。6-OHDA是一種神經(jīng)毒素，與DA在分子結(jié)構(gòu)上相似，但不能夠通過血腦屏障，需腦內(nèi)局部定位注射才能損毀中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。注射到中腦黑質(zhì)的6-OHDA與DA競爭性進(jìn)入細(xì)胞，其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，能在細(xì)胞內(nèi)外自動氧化為6-羥多胺醌(6-OHDAO)和活性氧(ROS)，單胺氧化酶(MAO)誘導(dǎo)其生成H2O2，F(xiàn)e2+與H2O2進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生羥自由基，作用于細(xì)胞膜, 引發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)化、蛋白和DNA結(jié)構(gòu)的變化[6,7]。另外, H2O2可對線粒體氧化呼吸鏈產(chǎn)生直接的抑制作用，引起細(xì)胞能量衰竭, 最終使黑質(zhì)-紋狀體通路DA能神經(jīng)元的變性、缺失, 從而使DA受體處于超敏狀態(tài)。APO是DA受體激動劑，在注射APO后，損毀側(cè)受體數(shù)量增多，高敏感使健側(cè)肢體產(chǎn)生PD癥狀，運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直，雙側(cè)運(yùn)動不能平衡而向健側(cè)旋轉(zhuǎn)[8]。雖6-OHDA定位注射誘導(dǎo)的PD動物模型黑質(zhì)內(nèi)并沒有典型的Lewy小體形成，但能夠產(chǎn)生與人類PD相似的病理及生化表現(xiàn), 包括黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性死亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生、黑質(zhì)紋狀體(TH)活性和DA含量降低等[9]。因此，此法成為制造PD動物模型的常用方法。

圖1 大鼠腦組織HE染色觀察

圖2 大鼠腦組織TH免疫組織化學(xué)染色觀察

目前，利用6-OHDA建立PD大鼠模型的方法中，主要的注射部位有中腦黑質(zhì)致密區(qū)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)及紋狀體等，中腦黑質(zhì)致密區(qū)是DA能神經(jīng)元最密集的部位；腹側(cè)被蓋區(qū)因解剖范圍小，常發(fā)生變異，不便于定位，單獨(dú)應(yīng)用的模型成功率不高; 紋狀體范圍大，易于定位，通過DA能神經(jīng)元末梢對6-OHDA的吸收，使其發(fā)生逆行性變性，從而破壞中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元。

本文選擇中腦單點(diǎn)、中腦雙點(diǎn)和紋狀體單點(diǎn)雙注進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示中腦單點(diǎn)組造模成功率為72.7%，中腦雙點(diǎn)組成功率比中腦單點(diǎn)組低(P＜0.05)，為60.0%, 可能與中腦雙點(diǎn)組中每點(diǎn)的6-OHDA劑量比中腦單點(diǎn)組低有關(guān); 而紋狀體單點(diǎn)雙注組造模成功率最低(P＜0.05), 為47.6%，原因可能是紋狀體范圍過大, 與黑質(zhì)致密區(qū)和腹側(cè)被蓋區(qū)相比, 相同劑量的6-OHDA損毀的DA能神經(jīng)元數(shù)量有限。中腦單點(diǎn)組經(jīng)APO誘導(dǎo)，1周時(shí)成功PD模型平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為(7.3±0.2) r/min; 2周、4周時(shí)均較前增加(P＜0.05); 8周時(shí)較前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。中腦雙點(diǎn)組和紋狀體單點(diǎn)雙注組平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)亦有相似的變化趨勢，表明6-OHDA建立的PD大鼠模型具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。TH被普遍認(rèn)為是對包含DA在內(nèi)的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成有重要影響的第一限速酶, 細(xì)胞表達(dá)TH是判斷神經(jīng)元為多巴胺能神經(jīng)元的的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。本實(shí)驗(yàn)對各組成功PD大鼠損毀側(cè)進(jìn)行TH免疫組織化學(xué)染色, 發(fā)現(xiàn)中腦單點(diǎn)組、中腦雙點(diǎn)組及紋狀體單點(diǎn)雙注組TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組(P＜0.01), 驗(yàn)證了6-OHDA建立PD大鼠模型的可靠性。造模3 d內(nèi)中腦雙點(diǎn)組死亡2只, 紋狀體單點(diǎn)雙注組和對照組各死亡1只,而中腦單點(diǎn)組未出現(xiàn)死亡。大鼠的死亡除了與定位鉆孔對大鼠的損傷有關(guān)之外, 還與6-OHDA對損毀區(qū)細(xì)胞的破壞和操作過程中的人為因素有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中腦單點(diǎn)組24 μg 6-OHDA在中腦黑質(zhì)致密區(qū)單點(diǎn)注射建立PD大鼠模型，操作過程相對簡便, 成功率高, 模型穩(wěn)定, 且動物死亡率低，是一種較為理想的PD大鼠模型建立方法。