衛(wèi)永華 ，劉永娟，楊莉，張志健，劉會平

1(山西師范大學 食品科學學院，山西 臨汾，041000) 2(陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中，723000) 3(天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津，300457)

超高壓(ultra-high pressure，UHP)處理技術是21世紀備受食品研究者關注的一種食品冷加工技術。與熱處理相同，它也可以引起蛋白質(zhì)變性、伸展[1-2]，內(nèi)部疏水基團暴露。若此時蛋白質(zhì)濃度、pH值、壓力大小、處理時間等因素合適，分子間或分子內(nèi)的氫鍵、二硫鍵、范德華力、疏水作用力等將相互作用，形成穩(wěn)定的、包裹有水分或其他成分的三維網(wǎng)狀結構，即超高壓凝膠。由于超高壓處理不會破壞氨基酸、維生素、色素和風味物質(zhì)等低分子化合物中的共價鍵，故可以較大程度地保持食品原材料的色、香、味及營養(yǎng)成分[3-4]，加工出質(zhì)地、消化性、風味等與熱處理不同的蛋白質(zhì)凝膠[5-7]。

近幾年來，超高壓技術在乳制品、魚糜制品以及蛋白質(zhì)凝膠食品中有著廣泛的應用。付強認為鰱魚魚糜經(jīng)超高壓處理后，不僅凝膠品質(zhì)顯著提高，而且風味和營養(yǎng)成分損失較小[8]。王安琪等認為，處理壓力的增大有利于提高魚糜樣品的剪切力、硬度、回復性、彈性和咀嚼性，且相關指標顯著優(yōu)于傳統(tǒng)熱殺菌(巴氏滅菌和高壓蒸汽滅菌)[9]；郭麗萍研究了超高壓結合熱處理對豬肉蛋白質(zhì)相互作用力的影響，發(fā)現(xiàn)處理后的肌原纖維蛋白質(zhì)巰基含量極顯著下降(p<0.01)，二硫鍵含量、疏水性極顯著上升(p<0.01)[10]。王苑等認為肌原纖維蛋白與大豆分離蛋白經(jīng)超高壓處理后所得新型凝膠的硬度、彈性及保水性均比傳統(tǒng)熱凝膠要好，且結構光滑致密[11]。

乳清蛋白具有良好的凝膠特性和營養(yǎng)特性，其在凝膠食品的組織結構調(diào)整方面具有廣泛的應用[12-14]。然而，目前國內(nèi)關于超高壓處理對乳清蛋白凝膠影響的研究還未見報道。本研究以乳清分離蛋白(whey protein isolated，WPI)為試驗原料，對其進行不同壓力、時間、WPI濃度、pH值和CaCl2條件下的超高壓處理，以考察超高壓處理條件對乳清分離蛋白凝膠特性的影響，為乳清蛋白在超高壓凝膠食品中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

乳清分離蛋白(WPI)(采用低溫離子交換技術生產(chǎn)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)92%)，購于美國Hilmar公司；其他所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

HPP.M1型超高壓處理設備，天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；Anke TDL-5-A臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；JSM-6380LV掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社JEOL；TA3XT Plus型質(zhì)構儀，英國Stable Micro System公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超高壓WPI凝膠制備工藝[15]

使用封口機將配制好的WPI溶液密封于耐高壓的聚乙烯袋中(不留氣泡)，然后放入壓力腔內(nèi)，浸沒于傳壓介質(zhì)中，設置壓力和時間參數(shù)后進行超高壓處理。處理后樣品置冰箱4℃保藏，所有性質(zhì)的測定在24h后進行，即只考慮不可逆的變化。

1.3.2 超高壓處理條件對WPI凝膠特性影響的研究

以凝膠強度、保水性和得率為考察指標，分別進行處理壓力(100、200、300、400和500 MPa)、處理時間(10、20、30和40 min)、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(120、140、160、180、200、220 g/L)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)和CaCl2濃度(0.03、0.06、0.09、0.12、0.15和0.18 mol/L)的單因素試驗。

1.3.3 WPI凝膠強度的測定[16]

將超高壓處理凝膠用質(zhì)構儀的TPA軟件系統(tǒng)測定。采用直徑為6 mm的圓柱型探針(P/6)以1 mm/s的恒定速度穿透凝膠，凝膠塊高度為10 mm，直徑24 mm。凝膠的硬度以探針的第一次壓縮循環(huán)中的最大力來表示，單位用g表示。所有測定值采用附屬解析軟件分析后直接從電腦中輸出。每個條件取3個樣品測定求其平均值。

1.3.4 WPI凝膠保水性測定[17]

將5 g左右凝膠放入離心管中于5 000×g離心10 min，然后倒出離心管內(nèi)游離水分，稱重。每個樣品平行測定3次，取其平均值。凝膠的保水性(water-holding capacity，WHC)則為：

WHC/%=(w2/w1)×100

(1)

式中：w1，離心前凝膠的質(zhì)量，g；w2，離心后凝膠的質(zhì)量，g。

1.3.5 WPI凝膠得率測定

用吸水紙除去凝膠表面的水分后，稱取凝膠塊質(zhì)量。凝膠得率計算公式如下：

Y/%=(m2/m1)×100

(2)

式中：m1，超高壓處理前WPI溶液質(zhì)量，g；m2，超高壓處理后形成凝膠塊的質(zhì)量，g。

1.3.6 WPI凝膠微觀結構觀察[17]

將凝膠樣品切成2 mm×2 mm×1 mm的小片，用2.5%(體積分數(shù))戊二醛在4 ℃條件下固定16 h，再分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%(體積分數(shù))的酒精溶液依次脫水，然后進行冷凍干燥，最后進行離子濺射鍍金處理，用掃描電子顯微鏡觀察凝膠的微觀結構。

1.3.7 WPI凝膠(或溶液)樣品中巰基和二硫鍵含量的測定

超高壓凝膠(或溶液)樣品中的巰基和二硫鍵含量分析采用郭麗萍的Ellman試劑分析法進行[10]。每個樣品平行測定3次，取其平均值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗結果用平均值±標準誤差表示。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 處理壓力對WPI凝膠的影響

2.1.1 處理壓力對WPI凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 7.0、濃度0.06 mol/L的CaCl2溶液中，配制成質(zhì)量濃度為160 g/L的溶液，分別經(jīng)100～500 MPa的壓力處理30 min，研究不同壓力對凝膠特性的影響。結果如表1所示。

表1 處理壓力對WPI凝膠特性的影響Table 1 The effects of applied pressure on the properties of WPI gel

注：表中同一指標值所標示字母不同時表示樣品指標有顯著差異(p<0.05)，表2、3、4和5與此相同。

由表1可以看出，WPI溶液經(jīng)100 MPa和200 MPa壓力處理后不形成凝膠。當處理壓力達到300 MPa時，形成凝膠的強度、得率和保水性均很低。隨著壓力的繼續(xù)升高，凝膠強度和保水性均顯著增加(p<0.5)。但WPI凝膠得率在400 MPa具有最大值，隨后呈現(xiàn)降低的趨勢。這意味著變性乳清蛋白在400 MPa時對水分的包裹能力最強，當壓力進一步增大時，可能凝膠網(wǎng)絡結構受到的擠壓作用也隨之增大，造成水分流失，得率下降[18]。

2.1.2 處理壓力對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響

處理壓力對凝膠中巰基和二硫鍵含量影響的結果如圖1所示。

圖1 處理壓力對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響Fig.1 The effects of treatment pressure on SH group and disulfide bond content in WPI gel processed by UHP注：圖中同一指標值所標示字母不同時表示樣品指標有顯著差異(p<0.05)，圖3、5、7和9與此相同。

天然β-乳球蛋白中包埋著許多疏基，在超高壓的作用下，β-乳球蛋白分子變性，球狀結構遭到破壞，內(nèi)部的疏水基團暴露于溶劑當中。新暴露出來的巰基將在氧化作用或巰基/二硫鍵交換作用下形成二硫鍵，從而對WPI凝膠的網(wǎng)絡結構起著重要的穩(wěn)定作用[10]。由圖1可以看出，隨著壓力增大，凝膠中巰基含量顯著下降(p<0.01)，二硫鍵含量顯著上升(p<0.01)。這表明隨著壓力的增大，WPI分子中越來越多的巰基轉化為二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)作用增強，凝膠品質(zhì)得以提高。

2.1.3 處理壓力對WPI凝膠微觀結構的影響

處理壓力對凝膠微觀結構影響的結果如圖2所示。

由圖2可以看出，當處理壓力為300 MPa時，球狀蛋白分子展開程度低，變性蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)作用也少，形成的網(wǎng)絡結構中孔洞較大。隨著壓力的上升，二硫鍵廣泛形成，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結構越致密，孔洞越細小[19-22]。這一方面提高了凝膠的強度，另一方面增加了凝膠體內(nèi)毛細管作用力，有利于提高凝膠的持水能力和得率。另有報道，超高壓有助于氫鍵的形成[23]，這也是壓力升高導致凝膠保水性增強的又一原因。

2.2 處理時間對WPI凝膠的影響

2.2.1 處理時間對WPI凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 7.0、濃度0.06 mol/L的CaCl2溶液中，配制成質(zhì)量濃度為16 g/L的溶液，分別經(jīng)500 MPa的壓力處理10～30 min，研究不同處理時間對凝膠特性的影響。結果如表2所示。

表2 處理時間對WPI凝膠特性的影響Table 2 The effects of treatment time on the properties of WPI gel

質(zhì)量濃度為160 g/L的WPI溶液在室溫條件下，經(jīng)500 MPa處理10 min就可形成凝膠。但由表2可知，處理時間≤20 min時，WPI凝膠強度和得率均較低，保水性也較差；處理時間高于20 min后，凝膠強度、得率和保水性均顯著提高(p<0.5)，但凝膠強度在處理時間超過30 min后，變化不顯著(p<0.5)。有研究表明，超高壓處理雖然可以促進蛋白分子變性、凝聚，但聚合到一定程度時，延長處理時間對蛋白交聯(lián)效果影響不再顯著，甚至會導致凝膠已有致密、有序網(wǎng)絡結構的破壞，使其凝膠硬度降低[24]。

2.2.2 處理時間對WPI巰基和二硫鍵含量的影響

處理時間對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響如圖3所示。

圖3 處理時間對WPI凝膠(或溶液)中巰基和二硫鍵含量的影響Fig.3 The effects of treatment time on SH group and disulfide bond content in WPI gel or solution processed by UHP

由圖3可以看出，WPI溶液經(jīng)500 MPa的壓力處理0～20 min時，巰基含量隨處理時間的延長顯著下降(p<0.01)，二硫鍵含量顯著上升(p<0.01)。而當處理時間大于20 min后，巰基含量變化不明顯，二硫鍵的含量仍緩慢增加。但如2.2.1所述，此時二硫鍵含量的增加只引起凝膠得率和保水性能的提高，并未對凝膠強度產(chǎn)生影響。

2.2.3 處理時間對WPI凝膠微觀結構的影響

處理時間對凝膠微觀結構影響的結果如圖4所示。

如圖4所示，在500 MPa壓力、處理時間為10 min時，WPI凝膠主要為顆粒狀聚集物，蛋白質(zhì)分子之間交聯(lián)作用很弱；當處理時間延長至20 min時，蛋白質(zhì)分子展開程度增大，初步形成一定的網(wǎng)絡結構，但相互之間交聯(lián)作用仍然較弱；WPI凝膠表現(xiàn)出較低的凝膠強度、得率和保水性。當處理時間分別為30 min和40 min時，WPI分子間的交聯(lián)作用比較充分，網(wǎng)絡結構更加致密，表現(xiàn)出較好的凝膠特性。由此可見，蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡的形成都需要一個過程，并非瞬間完成。

圖4 不同處理時間下超高壓WPI凝膠掃描電鏡圖Fig.4 The scanning electron microscopic pictures of gels processed by UHP with different treatment time

2.3 WPI質(zhì)量濃度對凝膠的影響

2.3.1 WPI質(zhì)量濃度對凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 7.0、濃度0.06 mol/L的CaCl2溶液中，配制成120～220 g/L的溶液，分別經(jīng)500 MPa的壓力處理30 min，研究不同WPI濃度對凝膠特性的影響。結果如表3所示。

表3 WPI濃度對凝膠特性的影響Table 3 The effects of protein concentration on the properties of WPI gel

前期預實驗發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為100 g/L的WPI溶液在室溫下，經(jīng)500 MPa、30 min高壓處理后不能形成凝膠。由表3可知，當質(zhì)量濃度增至120 g/L時，即有較低強度的凝膠生成，并且凝膠強度隨著蛋白質(zhì)濃度的增大而增大。此結果表明，與熱致凝膠相同，一定質(zhì)量濃度的WPI也是超高壓凝膠形成的基本條件[25]。

在質(zhì)量濃度為120～220 g/L范圍內(nèi)，隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增加，凝膠得率提高幅度較大(p<0.5)。這說明高蛋白濃度凝膠包裹水分的能力要明顯高于低濃度蛋白凝膠。當WPI質(zhì)量濃度大于180 g/L時，凝膠保水性呈現(xiàn)下降趨勢(p<0.5)。這可能是對蛋白質(zhì)網(wǎng)絡較大的包裹能力而言，水分相對不足造成的。

2.3.2 WPI質(zhì)量濃度對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響

WPI質(zhì)量濃度對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響如圖5所示。

圖5 蛋白濃度對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響Fig.5 The effects of WPI concentration on SH group and disulfide bond content in WPI gel processed by UHP

由圖5可以看出，不同WPI質(zhì)量濃度溶液經(jīng)500 MPa相同壓力處理后，凝膠中的巰基和二硫鍵含量均隨WPI質(zhì)量濃度增加而增加(p<0.5)，且較高WPI質(zhì)量濃度(>160 g/L)凝膠中的二硫鍵含量要高于低質(zhì)量濃度(<160 g/L)凝膠。這可能與高濃度凝膠中巰基更易碰撞、結合形成二硫鍵有關，也是高質(zhì)量濃度WPI凝膠的特性整體上優(yōu)于低濃度凝膠的原因。

2.3.3 WPI質(zhì)量濃度對凝膠微觀結構的影響

WPI對凝膠微觀結構影響的結果如圖6所示。

由圖6可以看出，隨著WPI質(zhì)量濃度的增大，蛋白質(zhì)分子側鏈間相互交聯(lián)的機會增大，蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)作用逐漸增強，致使凝膠結構越牢固[26]。與此同時，凝膠網(wǎng)絡中的孔洞逐漸減小，質(zhì)地變得細膩。不同WPI質(zhì)量濃度凝膠微觀結構的觀察結果與其二硫鍵含量的測定結果相符。

圖6 不同WPI質(zhì)量濃度的超高壓凝膠掃描電鏡圖Fig.6 The scanning electron microscopic pictures of gels processed by UHP with different WPI concentration

2.4 pH對WPI凝膠的影響

2.4.1 pH對WPI凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 3.0～7.0、濃度0.06 mol/L的CaCl2溶液中，配制成160 g/L的溶液，分別經(jīng)500 MPa的壓力下處理30 min，研究不同pH值對凝膠特性的影響。結果如表4所示。

表4 pH值對WPI凝膠特性的影響Table 4 The effects of pH on the properties of WPI gel

pH值可通過改變分子的凈電荷改變分子間的吸引力、排斥力以及分子和溶劑之間的相互作用，從而使不同pH值的蛋白質(zhì)溶液形成凝膠的特性各不相同[27]。如表4所示，當WPI溶液pH值在乳清蛋白等電點(大約4.5～5.5)時，形成的凝膠強度、得率和保水性均較差。而WPI溶液pH值偏離等電點時，凝膠的品質(zhì)則會升高，且偏中性環(huán)境的凝膠特性更高。

蛋白質(zhì)在適宜pH值下才能接近到合適的距離，發(fā)生分子間的巰基-二硫鍵作用，完成分子交聯(lián)。并且只有在二硫鍵與疏水作用力、靜電作用力等達到平衡狀態(tài)時，才能形成具有較高強度、得率和持水能力的不可逆性凝膠網(wǎng)絡[25]。當pH值低于乳清蛋白等電點時，WPI凝膠則主要由分子間靜電作用和離子鍵維持，分子間二硫鍵作用很弱，分子間作用力以斥力為主[28]，所形成的凝膠的特性相對較低(p<0.5)；在pH值高于乳清蛋白等電點的時候，凝膠中由分子間二硫鍵發(fā)揮主要作用，其各項品質(zhì)指標均較高；在等電點附近，由于蛋白質(zhì)分子帶靜電量最少，相互之間靜電排斥也最小，蛋白質(zhì)分子在展開之前就發(fā)生物理性凝聚[26]，因而形成的凝塊缺乏彈性，含水量和得率也較低。但本研究對凝膠保水性評價時，由于凝膠在離心前后水分損失量較小，反而使得凝膠在等電點時表現(xiàn)出較高的保水性。

2.4.2 pH值對WPI巰基和二硫鍵含量的影響

pH值對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響如圖7所示。

圖7 pH值對WPI凝膠中巰基含量和二硫鍵的影響Fig.7 The effects of pH on SH group and disulfide bond content in WPI gel processed by UHP

由圖7可以看出，在接近中性環(huán)境中，WPI凝膠中的巰基含量要明顯低于強酸性環(huán)境，而二硫鍵含量變化趨勢與巰基相反。這表明中性環(huán)境更有利于巰基/二硫鍵之間交換反應的發(fā)生。此結果與2.4.1部分中不同pH凝膠的品質(zhì)表現(xiàn)趨勢相一致。

2.4.3 pH值對WPI凝膠微觀結構的影響

pH值對WPI凝膠微觀結構影響的結果如圖8所示。

圖8 不同pH值下超高壓WPI凝膠掃描電鏡圖Fig.8 The scanning electron microscopic pictures of gels processed by UHP with different pH

由圖8可知，WPI溶液pH值在3.0～5.0時，經(jīng)超高壓處理生成的凝膠中并未表現(xiàn)出明顯的網(wǎng)絡結構，蛋白質(zhì)分子仍以球狀結構存在(圖8-a、8-b和8-c)，凝膠表現(xiàn)出較差的特性；當WPI溶液pH≥6.0，經(jīng)高壓處理生成的凝膠中，蛋白質(zhì)分子展開程度明顯增大，分子間相互作用增強，凝膠網(wǎng)絡也越來越致密(圖8-d、8-e、8-f)。相應地，凝膠的強度、保水性和得率均較高。此結果與不同pH凝膠中的二硫鍵含量測定結果相一致。

2.5 CaCl2濃度對WPI凝膠的影響

2.5.1 CaCl2濃度對WPI凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 7.0、濃度0.06～0.18 mol/L的CaCl2溶液中，配制成160 g/L的溶液，分別經(jīng)500 MPa的壓力下處理30 min，研究不同CaCl2濃度對凝膠特性的影響。結果如表5所示。

表5 CaCl2濃度對WPI凝膠特性的影響Table 5 The effects of CaCl2 on the properties of WPI gel

變性蛋白質(zhì)分子由于靜電排斥力而保持分離狀態(tài)，加入金屬鹽，可以屏蔽這些靜電排斥力，使盡可能多的蛋白質(zhì)分子相互接近。另外Ca2+可與蛋白質(zhì)通過氫鍵等形成“鍵橋”，這樣可加速凝膠網(wǎng)絡形成[28]，提高凝膠顆粒硬度[29]。由表5可知，CaCl2在0～0.15 mol/L能夠增加WPI凝膠強度(p<0.5)；當CaCl2濃度大于0.15 mol/L時，則會引起凝膠強度下降，可能原因是上升的CaCl2濃度引起蛋白質(zhì)的過度聚集，阻止了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡形成，導致凝膠脆性的增加[30-31]；WPI凝膠得率則隨著金屬鹽濃度的上升呈下降趨勢，可能是由CaCl2用量的增加造成變性蛋白質(zhì)分子凝集速度過快，網(wǎng)狀結構包裹的水分減少造成的。WPI凝膠保水性在CaCl2濃度為0.06 mol/L時具有最大值，CaCl2濃度進一步上升則會使蛋白質(zhì)膠凝速度過快，顆粒大小不均勻，毛細管作用降低，最終導致凝膠保水性下降[32]。

2.5.2 CaCl2濃度對WPI巰基和二硫鍵含量的影響

CaCl2濃度對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響如圖9所示。

圖9 CaCl2對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響Fig.9 The effect of CaCl2 on SH group and disulfide bond content in WPI gel processed by UHP

由圖9可以看出，CaCl2的添加對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量沒有明顯影響(p<0.5)，這表明Ca2+對蛋白質(zhì)分子中巰基的暴露與二硫鍵的形成沒有影響。

2.5.3 CaCl2濃度對WPI凝膠微觀結構的影響

CaCl2濃度對WPI凝膠微觀結構影響的結果如圖10所示。

圖10 含不同濃度CaCl2的超高壓WPI凝膠掃描電鏡圖Fig.10 The scanning electron microscopic pictures of gels processed by UHP with different CaCl2 concentration

如圖10所示，隨著CaCl2濃度的增加，蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用增強，形成的凝聚體顆粒增大，有助于凝膠網(wǎng)絡結構的形成。但當CaCl2濃度大到一定程度時，蛋白質(zhì)發(fā)生過度凝聚造成網(wǎng)絡空隙增大。這也是造成凝膠細膩程度變差、得率和保水性下降的原因。

3 結論

(1)當處理壓力≥300 MPa、處理時間≥10 min、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度≥120 g/L時，WPI溶液經(jīng)超高壓處理后才可以形成凝膠，且隨著處理壓力增大、處理時間延長和蛋白質(zhì)濃度的提高，凝膠中的游離巰基含量逐漸下降，二硫鍵含量明顯增加，凝膠網(wǎng)絡結構趨于致密，質(zhì)地逐漸細膩，凝膠強度、得率和保水性呈現(xiàn)增大的趨勢；

(2)WPI溶液pH在等電點以上且接近中性時，形成的凝膠中二硫鍵含量高，凝膠網(wǎng)絡致密，凝膠強度、得率和保水性較高；在等電點附近及以下時，凝膠的特性和品質(zhì)較差；

(3)添加CaCl2對形成凝膠中的二硫鍵含量不產(chǎn)生影響，但其可以通過鍵橋作用提高凝膠強度；凝膠得率與CaCl2濃度呈負相關；當CaCl2濃度為0.06 mol/L時，凝膠具有較大持水能力，之后保水性隨Ca2+濃度的升高而下降。