彭?xiàng)鳎瑒⑿阆?，陳靜，楊艷坤，白仲虎*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)3(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，已被廣泛用于谷氨酸、賴氨酸等氨基酸的生產(chǎn)，以及食品工業(yè)、動(dòng)物飼料和醫(yī)藥開發(fā)等領(lǐng)域，是一種普遍認(rèn)為安全(generally recognized as safe, GRAS)的表達(dá)宿主[1]。由于其無(wú)內(nèi)毒素?zé)o致病性，可以分泌正確折疊的活性蛋白直接到胞外上清液中等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)C.glutamicum也被開發(fā)作為一種新的外源蛋白表達(dá)宿主[2]。同時(shí)，隨著發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化來(lái)提高生物反應(yīng)器中產(chǎn)物產(chǎn)量以及遺傳學(xué)改造來(lái)增強(qiáng)宿主蛋白合成能力等技術(shù)被開發(fā)運(yùn)用[3-4]，也使得C.glutamicum越來(lái)越多地應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)。近十年來(lái)已有多種外源真核及原核蛋白在C.glutamicum中被高效表達(dá)的報(bào)道和應(yīng)用。例如葡萄球菌核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、人源抗體片段和胰島素等[5-6]。

目前C.glutamicum中，外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)依據(jù)啟動(dòng)子作用方式分為誘導(dǎo)型及組成型表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)型系統(tǒng)在表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒害作用的蛋白時(shí)有很好的效果，組成型表達(dá)可以得到很高的表達(dá)量[7-8]。外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)按照蛋白表達(dá)后的去向可分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌型兩種表達(dá)策略，細(xì)胞分泌較少的宿主細(xì)胞蛋白到胞外，分泌型表達(dá)可降低下游純化難度[9]。然而，因?yàn)樾盘?hào)肽的不同選擇以及分泌過(guò)程中斷裂的影響，分泌表達(dá)有時(shí)會(huì)得到不正確折疊的蛋白。胞內(nèi)表達(dá)可以提供蛋白正確折疊的內(nèi)環(huán)境，但胞內(nèi)蛋白酶較胞外多，會(huì)造成更多的外源蛋白降解[10]。所以，利用谷氨酸棒桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目標(biāo)蛋白時(shí)需要解決的一個(gè)重要問(wèn)題就是選擇哪種表達(dá)模式組合能夠達(dá)到最優(yōu)的表達(dá)效果。本研究試圖在C.glutamicum中找到表達(dá)腦鈉肽(BNP)的最優(yōu)表達(dá)模式。

BNP是一種肽類激素，它具有排鈉利尿、舒張血管以及抗腎素的作用[11]。BNP屬于一個(gè)結(jié)構(gòu)相似的肽類激素家族，此家族還包括心房肽(atrial natriuretic peptide, ANP)、C型腦鈉肽(C-type natriuretic peptide, CNP)和尿擴(kuò)張素。BNP分子由32個(gè)氨基酸殘基組成，在第10位半胱氨酸和第26位半胱氨酸之間有1個(gè)二硫鍵[12]。

BNP是腦鈉肽前體原(pro-brain natriuretic peptide, proBNP)的蛋白酶裂解產(chǎn)物。BNP以及沒(méi)有分解的proBNP都被分泌到血液中并在血液中循環(huán)[13]。已確定proBNP的合成隨著心壁的張力上升而增加，繼而導(dǎo)致血液中BNP和proBNP濃度的升高[14]。這兩種多肽濃度在心力衰竭、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、心肌病、心臟瓣膜疾病、心房纖維性顫動(dòng)和心臟淀粉樣變性等不同的心臟病患者樣品中都有升高[15]。心衰患者血液中這兩種多肽的濃度與疾病的嚴(yán)重程度成正比。因此，血液中此種肽的檢測(cè)被廣泛用于鑒定心衰患者和檢測(cè)心衰的嚴(yán)重程度[16]。BNP蛋白作為心血管檢查試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品和校準(zhǔn)品，目前尚未有用C.glutamicum表達(dá)BNP蛋白的相關(guān)報(bào)道，而作為GRAS菌株生產(chǎn)的蛋白在藥品審批時(shí)比非安全菌株會(huì)更有優(yōu)勢(shì)。

本研究基于pXMJ19質(zhì)粒骨架，整合Ptac啟動(dòng)子、gfp基因、Ncgl0949信號(hào)肽等基因表達(dá)元件，構(gòu)建了一套高效的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)分為誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)、組成型胞內(nèi)表達(dá)、誘導(dǎo)型分泌表達(dá)、組成型分泌表達(dá)4種表達(dá)模式組合，同時(shí)這4種模式組合被用來(lái)研究BNP在谷氨酸棒狀桿菌中的最適表達(dá)模式。研究結(jié)果將對(duì)以谷氨酸棒狀桿菌作為宿主快速表達(dá)外源蛋白具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

谷氨酸棒狀桿菌C.glutamicumCGMCC1.15647用于外源蛋白的表達(dá)，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。大腸桿菌E.coliDH5α用于質(zhì)粒的克隆和構(gòu)建，本研究室保藏。pXMJ19用于谷氨酸棒狀桿菌中蛋白表達(dá)，質(zhì)粒pEGFP為綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒，均由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要的試劑

質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒及PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。RNA反轉(zhuǎn)錄，熒光定量，T4 DNA連接酶及In-Fusion重組試劑購(gòu)自Takara公司。RNA提取試劑盒和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司。BNP標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自羅氏。氯霉素購(gòu)自上海生物工程有限公司。引物由蘇州金唯智合成。所用引物見表1。

表1 擴(kuò)增引物序列Table 1 Primers used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)溫度為37 ℃，LBB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基中添加1%腦心浸液)用于培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌，培養(yǎng)溫度為30 ℃。如需添加抗生素，氯霉素在大腸桿菌中的使用終質(zhì)量濃度為30 mg/L，在谷氨酸棒狀桿菌中的使用終質(zhì)量濃度為10 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 谷氨酸棒狀桿菌組成型表達(dá)載體的構(gòu)建

Ptac啟動(dòng)子為L(zhǎng)ac(乳糖啟動(dòng)子)與Trp(色氨酸啟動(dòng)子)結(jié)合而成的雜合啟動(dòng)子，當(dāng)有l(wèi)acIq基因產(chǎn)生阻遏蛋白時(shí)啟動(dòng)子為IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，去掉阻遏蛋白基因時(shí)啟動(dòng)子會(huì)成為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子[17]。以pXMJ19 為質(zhì)粒骨架，利用引物tacF和tacR擴(kuò)增Ptac啟動(dòng)子序列Ptac-C，同時(shí)在5’端引入EcoRV酶切位點(diǎn)，在3’端引入HindIII酶切位點(diǎn)。利用EcoRV和HindIII酶切pXMJ19，刪除掉載體中的Ptac啟動(dòng)子及l(fā)aIq區(qū)域，酶切回收后的載體片段與同樣用限制性EcoRV和HindIII消化回收后的Ptac片段連接，構(gòu)建pXMJ19組成型表達(dá)載體pXMJ19C(圖1)。

圖1 pXMJ19C組成型表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 The plasmid construction of pXMJ19C

1.2.2 谷氨酸棒狀桿菌GFP胞內(nèi)表達(dá)載體的構(gòu)建

以pEGFP質(zhì)粒為模板利用引物gfpF和gfpR擴(kuò)增gfp基因，同時(shí)在gfp基因ATG之前加上SD(AAAGGAGGACAACTA)序列，在片段的5’端引入HindIII酶切位點(diǎn)，在3’端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的片段經(jīng)過(guò)凝膠電泳分析，利用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI消化回收后，與同樣用HindIII和EcoRI消化回收后的載體pXMJ19連接，連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布于30 mg/mL氯霉素的LB瓊脂平板過(guò)夜培養(yǎng)，再挑取單菌落接種LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，正確的質(zhì)粒即為谷氨酸棒狀桿菌中GFP蛋白胞內(nèi)誘導(dǎo)型表達(dá)載體pXMJ19-gfp。

同樣的將擴(kuò)增的片段經(jīng)過(guò)凝膠電泳分析，限制性內(nèi)切酶消化回收后，連接到同樣經(jīng)HindIII和EcoRI酶切消化回收后的組成型表達(dá)載體pXMJ19C中，構(gòu)建GFP胞內(nèi)組成表達(dá)載體pXMJ19C-gfp。

1.2.3 谷氨酸棒狀桿菌GFP分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建

以pEGFP為質(zhì)粒骨架，合成SD序列插入到gfpATG之前，SD序列前插入Ncgl0949信號(hào)肽(ATGCAAATAAACCGCCGAGGCTTCTTAAAAGCCACCGCAGGA CTTGCCACTATCGGCGCTGCCAGCATGTTTATGCCAAAGGCCAAC GCCCTTGGAGCA)，利用引物0949gfpF和0949gfpR擴(kuò)增sgfp片段，在5’端引入HindIII酶切位點(diǎn)，在3’端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI消化回收后，連接到經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的表達(dá)載體pXMJ19及pXMJ19C中，構(gòu)建成GFP蛋白的誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體pXMJ19-sgfp及組成型分泌表達(dá)載體pXMJ19C-sgfp。

1.2.4 谷氨酸棒狀桿菌中BNP胞內(nèi)表達(dá)載體的構(gòu)建

人源的BNP蛋白(GenBank: NP_002512.1)經(jīng)過(guò)谷氨酸棒狀桿菌密碼子優(yōu)化后合成bnp基因，bnp基因ATG前加入SUMO基因(GenBank: KP405837.1)，SUMO多用于融合蛋白的切除，也有報(bào)道SUMO具有促進(jìn)蛋白折疊，促進(jìn)蛋白可溶的特點(diǎn)[18]，本研究中引入SUMO用于促進(jìn)BNP的表達(dá)。SUMO基因前引入組氨酸標(biāo)簽(CATCATCACCACCACCAC)，然后再引入SD序列，以引物bnpF和bnpR擴(kuò)增bnp片段，最終的片段兩端分別引入pXMJ19載體SmaI位點(diǎn)兩端同源序列，通過(guò)同源重組的方法連接到pXMJ19和pXMJ19C中，分別構(gòu)建BNP蛋白的組成型胞內(nèi)表達(dá)載體pXMJ19-bnp和誘導(dǎo)型的胞內(nèi)表達(dá)載體pXMJ19C-bnp。

1.2.5 谷氨酸棒狀桿菌BNP分泌表達(dá)載體

谷氨酸棒狀桿菌密碼子優(yōu)化后的bnp基因，ATG前加入SUMO基因， SUMO基因前引入組氨酸標(biāo)簽，組氨酸標(biāo)簽前加入Ncgl0949信號(hào)肽，信號(hào)肽前再加入SD序列，以引物0949bnpF和0949bnpR擴(kuò)增sbnp片段，片段兩端引入pXMJ19載體SmaI位點(diǎn)兩端同源序列，通過(guò)同源重組的方法連接到pXMJ19和pXMJ19C 中，構(gòu)建BNP蛋白的組成型分泌表達(dá)載體pXMJ19-sbnp和誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體pXMJ19C-sbnp。

1.2.6 轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌

谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)的制作方法及電擊轉(zhuǎn)化方法依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]。

1.2.7 GFP的表達(dá)鑒定

為了分析GFP以不同的表達(dá)模式組合在谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)情況，將包含有不同GFP表達(dá)載體的菌株接種到24孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，按1∶10的比例轉(zhuǎn)接到2 mL新鮮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24 h， 需要添加誘導(dǎo)劑的在培養(yǎng)8 h時(shí)添加濃度為0.01 mmol/L的IPTG。Dark Reader，SDS-PAGE及多功能酶標(biāo)儀被用來(lái)分析GFP的表達(dá)量。取2 mL培養(yǎng)液分為2份，于12 000 r/min離心，菌體和上清分開，菌體PBS洗滌2遍后，用Dark Reader 來(lái)觀察不同菌株的菌體和發(fā)酵上清熒光情況。每份菌體用1 mL PBS重懸，1份菌懸液高通量破碎后，取破碎上清和發(fā)酵液上清一起用SDS-PAGE來(lái)檢測(cè)GFP的表達(dá)量。另1份菌懸液取200 μL和200 μL發(fā)酵液利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量熒光，熒光測(cè)量條件為激發(fā)488 nm發(fā)射507 nm。

1.2.8 不同表達(dá)模式gfp轉(zhuǎn)錄水平分析

為了分析不同表達(dá)模式GFP表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系，以gfp基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)熒光定量引物RTgfpF和RTgfpR。不同表達(dá)模式GFP表達(dá)菌株的培養(yǎng)條件與GFP表達(dá)量測(cè)定時(shí)相同，取樣點(diǎn)選取在加入IPTG前2 h和加入后2 h即培養(yǎng)的6 h和10 h，使用RNA提取試劑盒提取谷氨酸棒狀桿菌的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用RT-PCR檢測(cè)gfp基因的轉(zhuǎn)錄水平。以16S rRNA為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法測(cè)定gfp基因的相對(duì)表達(dá)量。RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及熒光定量體系參考試劑盒說(shuō)明書。

1.2.9 BNP的表達(dá)鑒定

為了分析BNP在不同表達(dá)模式下的表達(dá)情況，將包含有BNP表達(dá)質(zhì)粒的菌株接種到24孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后按1∶10的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的2 mL培養(yǎng)基中，需要添加誘導(dǎo)劑的在培養(yǎng)8 h后添加濃度0.01 mm的IPTG，培養(yǎng)至24 h。SDS-PAGE，Western Bolt，化學(xué)發(fā)光法被用來(lái)分析BNP的表達(dá)。收獲后的細(xì)胞 1 mL 12 000 r/min 離心10 min，分別收集發(fā)酵液上清和菌體。菌體PBS洗滌2遍后冰上超聲波破碎。破碎后的上清，發(fā)酵液上清都通過(guò)SDS-PAGE來(lái)檢測(cè)。 同時(shí)通過(guò)Western Blot來(lái)分析BNP的表達(dá)?；瘜W(xué)發(fā)光法利用雙抗體夾心法，通過(guò)光子數(shù)來(lái)指示BNP的表達(dá)量，具體操作方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.10 BNP的純化

包含有BNP表達(dá)載體的菌株接種到20 mL LBB培養(yǎng)基中30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后按1∶10稀釋到200 mL培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h，細(xì)胞收獲后4 ℃ 4 000 r/min 離心去上清，菌體用PBS洗滌2次，冰上超聲破碎。BNP利用AKTA純化儀并利用HisTrap HP進(jìn)行純化，純化后的蛋白利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，并利用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酸棒狀桿菌中GFP不同表達(dá)模式菌株的構(gòu)建

組合誘導(dǎo)型、組成型、胞內(nèi)以及分泌4種表達(dá)方式，外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)可分為誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)、組成型胞內(nèi)表達(dá)、誘導(dǎo)型分泌表達(dá)及組成型分泌表達(dá)4種模式。為了在谷氨酸棒狀桿菌中快速構(gòu)建這4種表達(dá)系統(tǒng)，研究中選取GFP作為模式蛋白，結(jié)合SD序列，利用Ptac誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和Ptac-C組成型啟動(dòng)子分別構(gòu)建了 GFP誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)載體pXMJ19-gfp和組成型胞內(nèi)表達(dá)載體pXMJ19C-gfp; 同時(shí)結(jié)合SD序列，Ncgl0949信號(hào)肽構(gòu)建成誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體pXMJ19-sgfp和組成型分泌表達(dá)載體pXMJ19C-sgfp。構(gòu)建完成的表達(dá)載體通過(guò)酶切、PCR和測(cè)序來(lái)驗(yàn)證(圖2)。正確的載體轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌即構(gòu)建成相應(yīng)的GFP表達(dá)菌株。

M-DL10 000 marker；1,2,3,4分別為質(zhì)粒pXMJ19-gfp，pXMJ19C-gfp，pXMJ19-sgfp和pXMJ19C-sgfp的酶切驗(yàn)證結(jié)果，5,6,7,8分別為PCR驗(yàn)證結(jié)果圖2 GFP表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of plasmids for GFP expression

2.2 GFP在谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證所構(gòu)建的4種表達(dá)系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中是否可行，以GFP作為模式蛋白，分析了GFP在這4種表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量差異。以含有pXMJ19 的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化子作為陰性對(duì)照，利用24孔板培養(yǎng)不同類型GFP表達(dá)菌株，利用SDS-PAGE，多功能酶標(biāo)儀及Dark Reader來(lái)分析不同表達(dá)模式下GFP的表達(dá)水平。Darker Reade結(jié)果表明，胞內(nèi)表達(dá)的只在菌體中有熒光，分泌表達(dá)的只在上清中有熒光，分泌表達(dá)的誘導(dǎo)型比組成型菌株熒光強(qiáng)度高(圖3-a，圖3-b)。培養(yǎng)液的菌體和上清分別用SDS-PAGE 和多功能酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè)。結(jié)果表明GFP的組成型胞內(nèi)表達(dá)量是誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)的1.2倍，是誘導(dǎo)型分泌表達(dá)的1.9倍，是組成型分泌表達(dá)的2.9倍(圖3-c，圖3-d)。說(shuō)明4種表達(dá)模式都能在谷氨酸棒狀桿菌中成功表達(dá)外源蛋白，但對(duì)于GFP蛋白，組成型胞內(nèi)表達(dá)是更好的表達(dá)方式。

2.3 不同表達(dá)模式下gfp轉(zhuǎn)錄水平分析

為了分析不同表達(dá)模式對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響，本研究以16S rRNA作為內(nèi)參基因，使用RT-PCR測(cè)定了4種表達(dá)模式下gfp的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果可以看出，組成型的胞內(nèi)表達(dá)及誘導(dǎo)型的胞內(nèi)表達(dá)具有相似的轉(zhuǎn)錄水平，明顯高于組成型分泌表達(dá)及誘導(dǎo)型分泌表達(dá)模式下的gfp轉(zhuǎn)錄水平。說(shuō)明分泌型表達(dá)元件的加入影響了gfp基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，組成型分泌表達(dá)模式和誘導(dǎo)型分泌表達(dá)模式下都能觀察到gfp的轉(zhuǎn)錄，說(shuō)明這2種表達(dá)模式GFP表達(dá)量的差異不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上(圖4)。

a-Darker Reade分析不同菌株菌體的熒光強(qiáng)度；b-Darker Reade分析不同菌株培養(yǎng)液上清的熒光強(qiáng)度；c-SDS-PAGE分析不同菌株GFP表達(dá)水平；d-多功能酶標(biāo)儀分析不同菌株GFP的表達(dá)水平；1-菌體陰性對(duì)照；2-誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)的菌體；3-組成型胞內(nèi)表達(dá)的菌體；4-誘導(dǎo)型分泌表達(dá)的菌體；5-組成型分泌表達(dá)的菌體；6-上清陰性對(duì)照；7-誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)的上清；8-組成型胞內(nèi)表達(dá)的上清；9-誘導(dǎo)型分泌表達(dá)的上清；10-組成型分泌表達(dá)的上清；M-蛋白marker；CK-菌體陰性對(duì)照；GFP-誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)的菌體；CGFP-組成型胞內(nèi)表達(dá)的菌體；CKS-上清陰性對(duì)照；SGFP-誘導(dǎo)型分泌表達(dá)的上清；CSGFP-組成型分泌表達(dá)的上清圖3 GFP表達(dá)量的檢測(cè)Fig.3 Detection of the expression of GFP

2.4 谷氨酸棒狀桿菌中BNP不同表達(dá)模式菌株的構(gòu)建

GFP-誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)；CGFP-組成型胞內(nèi)表達(dá)； SGFP-誘導(dǎo)型分泌表達(dá)；CSGFP-組成型分泌表達(dá)圖4 gfp轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.4 Relative quantification of gfp gene mRNA level

為了在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)BNP蛋白，同時(shí)探究BNP表達(dá)的最佳模式組合。本研究組裝Ptac誘導(dǎo)型及Ptac-C組成型啟動(dòng)子，SD序列，SUMO基因，bnp基因等表達(dá)元件分別構(gòu)建成BNP誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)載體pXMJ19-bnp和組成型胞內(nèi)表達(dá)載體pXMJ19C-bnp。同時(shí)，組裝SD序列，Ncgl0949信號(hào)肽，SUMO基因，bnp基因及Ptac誘導(dǎo)型和組成型啟動(dòng)子分別構(gòu)建成BNP誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體pXMJ19-sbnp和組成型分泌表達(dá)載體pXMJ19C-sbnp。載體通過(guò)酶切，RCR基因和測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌構(gòu)建成相應(yīng)的BNP表達(dá)菌株(圖5)。

M-DL10000 marker；1,2,3,4分別為質(zhì)粒pXMJ19-bnp，pXMJ19C-bnp，pXMJ19-sbnp和pXMJ19C-sbnp的酶切驗(yàn)證結(jié)果，5,6,7,8分別為PCR驗(yàn)證結(jié)果圖5 BNP表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.5 Construction of plasmids for BNP expression

2.5 BNP蛋白在谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)分析

為了檢測(cè)BNP以不同表達(dá)模式在谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)情況，以含有pXMJ19轉(zhuǎn)化子作為陰性對(duì)照，利用24孔板培養(yǎng)包含有不同的BNP表達(dá)載體的菌株。1 mL培養(yǎng)液離心后，分別取上清和菌體通過(guò)SDS-PAGE 和Western Bolt 來(lái)分析不同菌株BNP的表達(dá)情況。結(jié)果表明，胞內(nèi)表達(dá)的組成型和誘導(dǎo)型都可以觀察到BNP的表達(dá)。誘導(dǎo)型分泌表達(dá)的上清中可以觀察到BNP的表達(dá)，組成型分泌觀察不到BNP蛋白的表達(dá)(圖6-a，圖6-b)。同時(shí)通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)BNP的表達(dá)量，BNP的表達(dá)量組成型胞內(nèi)表達(dá)是誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)的1.3倍，是誘導(dǎo)型分泌表達(dá)的3.3倍。組成型分泌表達(dá)并不能觀察到BNP蛋白的表達(dá)(圖6-c)。表明BNP不適合組成型分泌表達(dá)，組成型胞內(nèi)表達(dá)為最佳的表達(dá)模式。

a-SDS-PAGE分析不同菌株BNP表達(dá)水平；b-Western Bolt分析不同菌株BNP表達(dá)水平；c-化學(xué)發(fā)光法分析不同菌株BNP表達(dá)水平；M-蛋白marker；CK-菌體陰性對(duì)照；BNP-誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)的菌體；CBNP-組成型胞內(nèi)表達(dá)的菌體；CKS-上清陰性對(duì)照；SBNP-誘導(dǎo)型分泌表達(dá)的上清；CSBNP-組成型分泌表達(dá)的上清圖6 BNP表達(dá)量的檢測(cè)Fig.6 Detection of the expression of BNP

2.6 BNP的純化及抗原特性分析

經(jīng)過(guò)不同表達(dá)模式分析，組成型胞內(nèi)表達(dá)為BNP最優(yōu)的表達(dá)選擇。為了進(jìn)一步得到大量純化后的BNP蛋白，利用200 mL搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)液通過(guò)AKATA純化系統(tǒng)純化，純化產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)及通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒定量。通過(guò)一步純化，最終從1 L培養(yǎng)產(chǎn)物中分離純化得到235.5 mg BNP蛋白，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，純化效率可到90%以上(圖7-a)。取純化后的BNP(SUMO-BNP)及購(gòu)買的BNP標(biāo)品分別稀釋成不同的梯度，利用化學(xué)發(fā)光法分析純化后的BNP抗原特性。結(jié)果顯示純化后的BNP與標(biāo)品相比具有同樣的抗原特性(圖7-b)。

a-SDS-PAGE檢測(cè)純化后BNP的純度；b-化學(xué)發(fā)光法分析純化后的BNP抗原特性圖7 BNP蛋白的純化及抗原特性分析Fig.7 Analysis of purified of BNP

3 討論

谷氨酸棒狀桿菌越來(lái)越多的被應(yīng)用于合成生物學(xué)領(lǐng)域表達(dá)高附加值的化合物[20]，同時(shí)也被開發(fā)用來(lái)表達(dá)外源蛋白。外源蛋白在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)可分為誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)、組成型胞內(nèi)表達(dá)、誘導(dǎo)型分泌表達(dá)、組成型分泌表達(dá)幾種模式[7-9]，本研究利用GFP構(gòu)建了一套快速探索外源蛋白在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)模式的方法，同時(shí)利用這套方法探索了BNP蛋白的最適表達(dá)模式。

BNP蛋白被廣泛運(yùn)用于體外診斷行業(yè)，不經(jīng)糖基化修飾的BNP反而比糖基化修飾后的BNP具有更好的檢測(cè)效果[14]。至今尚未有在谷氨酸棒狀桿菌中成功表達(dá)BNP的相關(guān)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，BNP可以在胞內(nèi)組成型表達(dá)，同時(shí)也可以分泌形式表達(dá)，但分泌表達(dá)表達(dá)量非常低，組成型分泌表達(dá)甚至檢測(cè)不到BNP的表達(dá)(圖6)。雖然谷氨酸棒狀桿菌具有胞外蛋白酶少的特點(diǎn)，分泌表達(dá)將會(huì)簡(jiǎn)化提純步驟，但就目前的分泌信號(hào)肽，啟動(dòng)子，終止子的組合，胞內(nèi)表達(dá)是最理想的表達(dá)策略。以后的工作也會(huì)繼續(xù)研究不同的信號(hào)肽等表達(dá)元件的組合，探尋最佳的分泌表達(dá)模式。

BNP蛋白具有分子量小結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，等電點(diǎn)分析表明BNP蛋白的等電點(diǎn)為10.95，研究中嘗試直接表達(dá)BNP蛋白，但檢測(cè)不到蛋白的表達(dá)。SUMO等電點(diǎn)為4.66，多用于融合蛋白的切除，也有報(bào)道SUMO具有促進(jìn)蛋白折疊，促進(jìn)蛋白可溶的特點(diǎn)[18]。當(dāng)SUMO與融合BNP蛋白后，融合的蛋白等電點(diǎn)為6.59，偏近中性，推測(cè)可能會(huì)有助于蛋白的表達(dá)。最終結(jié)果也表明，BNP融合SUMO后，才可以檢測(cè)到BNP蛋白的表達(dá)，這也為在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)高等電點(diǎn)蛋白提供了一種表達(dá)思路。