葉美君, 陸小磊, 劉相真, 張海華, 杜穎穎, 潘勝東

(1. 中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院, 浙江 杭州 310016; 2. 寧波市疾病預防控制中心, 浙江省微量有毒化學物健康風險評估技術研究重點實驗室, 浙江 寧波 315010)

由中國農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.Chinapesticide.gov.cn)和文獻[1]可知,草甘膦(glyphosate, GLY)和草銨膦(glufosinate, GLUF)是我國登記的允許茶樹使用的除草劑,茶葉中草甘膦和草銨膦的最高殘留限量(RML)較低,與日本和歐盟等國家和地區(qū)的RML基本相近(中國為1.0 mg/kg和0.5 mg/kg,日本為1.0 mg/kg和0.3 mg/kg,歐盟為2.0 mg/kg和0.1 mg/kg)。茶多酚、氨基酸、咖啡堿、茶多糖等700余種內源性成分賦予茶葉獨特的健康保健功能的同時[2],極大地增加了茶葉中草甘膦和草銨膦檢測前處理和儀器分析的難度,進而影響樣品檢測的靈敏度(檢出限和定量限)、精密度(重復性)和準確度(回收率)。

草甘膦和草銨膦的檢測方法主要包括離子色譜法(IC)、高效液相色譜-熒光法(HPLC-FD)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)和液相色譜-質譜法(LC-MS)[3-5]。草甘膦和草銨膦及其主要代謝物氨甲基磷酸(minomethylphosphonic acid, AMPA)的分子質量小、極性大、不溶于有機溶劑、水溶性強,與有機物有很強的結合能力,直接分析難度較大[6]。黃嘉樂等[7]采用離子色譜法直接檢測茶葉中草甘膦和草銨膦,由于其定量限較高,依據(jù)GB 2763-2016《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中該除草劑的RML,該檢測方法無法滿足日常檢驗要求,因此植物源樣品主要采用衍生法間接檢測。茶葉中氨基酸種類繁多且含量高,草甘膦和草銨膦屬氨基酸類除草劑,該衍生產(chǎn)物與氨基酸衍生產(chǎn)物結構相似,熒光檢測器分辨能力低,假陽性高,不利于茶葉樣品的準確分析。氣相色譜-質譜法(GB/T 23750-2009)衍生試劑七氟丁醇(HFB)價格昂貴,衍生劑三氟乙酸酐(TFAA)易揮發(fā),衍生條件苛刻,日常檢驗應用較少。9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl)作為氨基酸的保護基團,用于固相多肽合成和有機物合成,也作為衍生試劑常用于氨基酸的定性定量分析[8-11]。Ibáez等[12]、曹趙云等[13]和吳曉剛等[14]將該衍生劑引入氨基酸類除草劑的檢測,Ibáez等報道了草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸衍生產(chǎn)物(FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA)的質譜圖,曹趙云等和吳曉剛等闡明該衍生產(chǎn)物在質譜中的裂解途徑。由于FMOC-Cl易溶于有機溶劑,不溶于水,而形成的衍生產(chǎn)物FMOC-GLY、FMOC-AMPA和FMOC-GLUF溶于水,基于這一特殊的理化特性,以FMOC-Cl為衍生試劑的柱前衍生-高效液相色譜-質譜法廣泛應用于茶葉中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸的檢測[14-21]。

基于FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)檢測技術成熟,實驗條件簡單,茶葉樣品的檢測難點主要集中在提取和凈化等前處理過程,該過程直接決定茶葉樣品中內源性物質的組成,并影響草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸的衍生反應轉化率,進而影響樣品檢測的靈敏度、精密度和準確度。本實驗選取水和0.2%(v/v)甲酸水溶液作為提取劑,超聲、振蕩和旋渦作為提取方式,草甘膦專用柱(Special SPE)、碳十八柱(C18柱)和陽離子交換柱(PCX)作為固相萃取(SPE)的凈化小柱,利用正交試驗設計方法,優(yōu)化提取劑、提取方式和固相萃取凈化小柱,系統(tǒng)研究提取和凈化等前處理過程對茶葉中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸檢測的影響。本文采用UPLC-MS/MS內標法對茶葉中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸定性定量分析,以靈敏度、精密度和準確度評價方法的適用性。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);分析天平(感量0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司); SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司); FJ-12A固相萃取裝置(上海京孚儀器有限公司);超純水系統(tǒng)(成都康寧實驗專用純水設備廠);漩渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 試劑與材料

甲醇(色譜純,美國Tedia公司);乙酸銨(色譜純,美國Fluka公司);甲酸、37%鹽酸(色譜純,德國Merck公司);十水四硼酸鈉(分析純,天津市風船化學試劑科技有限公司);磷酸二氫鉀(分析純,華東醫(yī)藥股份有限公司); FMOC-Cl(衍生級,純度≥ 99.9%,上海安譜科學儀器有限公司);草甘膦水溶液(100 μg/mL,AccuStandard, Inc);草銨膦(純度99.0%, AccuStandard, Inc);氨甲基膦酸(純度99.0%, Chem Service); 1,2-14C15N草甘膦(GLY-15N,純度96%, TRC); FMOC-GLY和FMOC-AMPA水溶液(10 μg/mL,Dr. Ehrenstorfer); FMOC-GLUF(純度96.2%, Dr. Ehrenstorfer); 100 mg/3 mL草甘膦專用柱(Special SPE,福建昊陽生物科技有限公司); 200 mg/3 mL C18小柱(C18,島津技邇商貿有限公司); 60 mg/3 mL陽離子交換柱(PCX,博納艾杰爾科技公司);茶粉(茶葉磨碎樣品,按照GB/T 8303-2013制備)。

1.3 標準溶液、硼酸鈉溶液和衍生液的配制

標準溶液配制:準確稱取10.0 mg(精確至0.1 mg)固體標準物質,分別用超純水溶解并配制成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液,于4 ℃冰箱中避光保存。將上述標準儲備液和液體標準品逐級稀釋,配成單標準溶液或混合標準溶液。

50.0 g/L硼酸鈉溶液:稱取9.46 g Na2B4O7510H2O,采用超純水溶解并定容至100 mL。

250 g/L氫氧化鈉溶液:稱取25.00 g NaOH,采用超純水溶解并定容至100 mL。

1.00 g/L FMOC-Cl丙酮溶液:稱取0.10 g FMOC-Cl,采用丙酮溶解并定容至100 mL。

酸度調節(jié)劑:稱取16.00 g磷酸二氫鉀溶于160 mL水,加入13.4 mL鹽酸和40 mL甲醇,超聲混合均勻。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質譜條件

色譜柱:Thermo Hypersil GOLD C18(150 mm×2.1 mm, 1.9 μm);流動相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸),流動相B為甲醇,梯度洗脫條件見表1;柱溫:40 ℃;進樣量:2.0 μL。

質譜電離模式:電噴霧離子化(ESI);電離源極性:正離子模式;霧化氣:氮氣;離子噴霧電壓:3 500 V;霧化室溫度:120 ℃;離子傳輸管溫度:350 ℃;碰撞氣:氬氣,0.2 Pa;掃描模式:選擇反應監(jiān)測掃描(SRM)。

表 1 梯度洗脫程序

A: 5 mmol/L ammonium acetate-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution; B: ethanol.

1.5 樣品前處理

提取:稱取茶粉2.5 g(精確至0.001 g)置于50 mL具塞聚乙烯離心管中,加入10 μg/mL草甘膦同位素內標100 μL,再加入20 mL超純水,旋渦提取30 min,以2 500 r/min轉速離心5 min,取上清液待凈化。

凈化:分別移取2.0 mL甲醇和2.0 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液依次活化小柱,準確移取1.0 mL提取上清液和100 μL酸度調節(jié)劑于10 mL離心管中混合后移取至小柱,再加入1.0 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液洗脫,采用250 g/L NaOH調節(jié)流出液至中性并加水定容至3 mL,待衍生。

衍生:取0.6 mL凈化液,分別依次加入0.2 mL 50.0 g/L硼酸鈉溶液,0.2 mL 1.0 g/L FMOC-Cl丙酮溶液,混勻后于25 ℃下衍生2 h, 0.2 μm有機微孔濾膜過濾,UPLC-MS/MS測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優(yōu)化和衍生產(chǎn)物確證

將FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的單標準溶液進質譜儀器直接分析,調節(jié)碰撞能量,以獲得穩(wěn)定性好、信號強度高的碎片離子,優(yōu)化得到的參數(shù)見表2。

在25 ℃下,GLY、AMPA和GLUF單標準溶液分別與FMOC-Cl溶液反應2 h,將該衍生反應溶液進質譜分析,譜圖顯示該衍生反應溶液的離子碎片與FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的單標準溶液離子碎片一致。設置液相色譜條件和質譜參數(shù),經(jīng)UPLC-MS/MS分析,FMOC-GLY、FMOC-GLU和FMOC-AMPA單標準溶液與該衍生反應溶液的液相色譜保留時間一致。由此可見,根據(jù)1.5節(jié)衍生條件和方法,GLY、GLUF和AMPA與FMOC-Cl反應的產(chǎn)物為FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA。

表 2 FMOC-GLY、FMOC-GLY-15N、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的質譜參數(shù)

* Quantitative ion pair.

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1GLY、GLUF和AMPA在不同固相萃取柱中的洗脫液用量

選取Special SPE、C18和PCX作為茶葉中GLY、GLUF和AMPA檢測的凈化小柱,以此考察不同固相萃取柱的凈化效果。為了確保目標物完全洗脫,首先進行流出液實驗,優(yōu)化各種固相萃取柱的洗脫液用量。以2 mL甲醇和2 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液活化小柱,移取1 mL 100 μg/L的混合標準溶液和100 μL酸度調節(jié)劑混合后移取至固相萃取柱,采用0.5%(v/v)甲酸水溶液為洗脫液,每次分別加入0.5 mL洗脫液,洗脫液用量見表3。

根據(jù)表3數(shù)據(jù)顯示,以0.5%(v/v)甲酸水溶液為洗脫劑,3種固相萃取柱的洗脫液用量相似,均為1 mL,試樣流出液中已存在草甘膦和氨甲基膦酸,前段流出液必須收集。

表 3 目標物在不同固相萃取柱中不同洗脫液用量下的洗脫效果

+: the target compounds were detected in eluate; -: none of target compounds were detected in eluate.

2.2.2提取溶劑、提取方式和固相萃取凈化柱的選擇

以水和0.2%(v/v)甲酸水溶液作為提取劑,超聲、振蕩和旋渦作為提取方式,Special SPE、C18和PCX為固相萃取凈化小柱,采用正交試驗設計研究前處理方法對茶葉中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸檢測的影響,樣品添加水平為0.400 mg/kg,實驗過程如1.5節(jié)所示,正交試驗設計見表4,實驗結果見表5,色譜圖見圖1。由圖1可知,在相同的色譜條件下,FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的保留時間分別約為:FMOC-GLY 4.62 min,FMOC-GLUF 4.91 min, FMOC-AMPA 4.79 min,經(jīng)Special SPE和C18柱凈化,FMOC-GLY和FMOC-GLUF與雜質峰尚未完全分離,且雜質峰響應相對FMOC-GLY和FMOC-GLUF響應較大;經(jīng)PCX柱凈化,FMOC-GLY與雜質峰完全分離,FMOC-GLY和FMOC-GLUF響應相對雜質峰響應較大。

表 4 正交試驗設計

表 5 GLY、GLUF和AMPA在不同前處理方法中的添加回收率和相對標準偏差(n=3)

圖 1 采用不同固相萃取小柱凈化的FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA色譜圖Fig. 1 Chromatograms of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC-AMPA purified by different SPE columns

圖 2 不同實驗條件下FMOC-GLY、FMOC-GLUF和 FMOC-AMPA的峰面積Fig. 2 Peak area of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC- AMPA under different experiment conditions

根據(jù)表5可知,No. 2、No. 4和No. 7的回收率為70%～120%,回收率數(shù)據(jù)尚無顯著差異性和規(guī)律性,相對標準偏差小于10%,滿足檢測要求。根據(jù)目標物的峰面積(見圖2)可知,采用PCX柱的No. 4和Special柱的No. 7, FMOC-GLY和FMOC-GLUF的響應較大,采用C18柱的No. 2, FMOC-AMPA響應較大。

圖 3 不同實驗條件下FMOC-GLY、FMOC-GLUF和 FMOC-AMPA的信噪比Fig. 3 S/N ratios of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC- AMPA under different experiment conditions

設計低水平添加實驗(在檢出限附近),通過信噪比(S/N)進一步確認最優(yōu)實驗方案。將添加水平為0.100 mg/kg的茶葉樣品按照No. 2、No. 4和No. 7試驗方案和1.5節(jié)的前處理過程進行處理,目標物的信噪比見圖3。根據(jù)圖3可知,在0.100 mg/kg添加水平下,采用PCX凈化柱的No. 4試驗和Special SPE凈化的No. 7試驗,草甘膦和草銨膦的信噪比較大,氨甲基膦酸在3支凈化柱上的信噪比相似。

綜合回收率、色譜分離度、目標物響應、雜質干擾和低濃度溶液的信噪比等因素,本實驗的最優(yōu)前處理方法即采用水為提取劑,旋渦為提取方式,PCX柱為凈化小柱。

2.3 方法評價

2.3.1標準曲線、基質效應、方法檢出限和定量限

分別以PCX柱凈化的茶提取液和純水配制基質標準溶液和溶劑標準溶液,以FMOC-Cl溶液進行衍生,以目標物與草甘膦同位素內標物的峰面積比值作為縱坐標,目標物濃度與草甘膦同位素內標物濃度的比值為橫坐標,繪制基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線?；|效應以η表示:η=(基質匹配標準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率)/溶劑標準曲線的斜率[22]。結果表明,在1～100 μg/L范圍內線性關系良好,基質匹配標準曲線、相關系數(shù)(R2)和基質效應參數(shù)見表6。由表6可知,η<10%,說明無明顯基質效應,由此可見,草甘膦同位素內標可以大幅度降低基質效應。在空白茶葉樣品中添加草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸,并經(jīng)1.5節(jié)樣品前處理方法處理,根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)確定方法的檢出限(LOD),根據(jù)0.050 0 mg/kg添加水平的回收率和RSD數(shù)據(jù)確認方法的定量限(LOQ)(見表6)。

表 6 線性范圍、基質匹配線性方程、相關系數(shù)、基質效應、檢出限和定量限

y: ratio of peak areas of target and internal standard;x: ratio of mass concentrations of target and internal standard.

2.3.2方法準確度和精密度

分別稱取2.50 g茶葉空白樣品,然后加入適量混合標準溶液,配制成低、中、高3個添加水平(0.050 0、0.400和1.20 mg/kg),按照1.5節(jié)樣品前處理方法進行提取、凈化和衍生,然后采用UPLC-MS/MS檢測,每一個加標水平測定6次,結果見表7。

表 7 草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸在茶葉中的添加回收率和RSD(n=6)

由表7可知,草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸在低、中、高3個水平均有著較好的準確度與精密度,符合實驗室日常檢測要求。

2.3.3與其他方法的比較

目前國內現(xiàn)行標準GB/T 23750-2009《植物性產(chǎn)品中草甘膦殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》、SN/T 1923-2007《進出口食品中草甘膦殘留量的檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》和SN/T 3983-2014《出口食品中氨基酸類有機磷除草劑殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》等前處理均采用美國Bio-Rad CAX陽離子交換樹脂小柱,按照上述標準方法對茶葉中草甘膦和草銨膦進行檢測,經(jīng)過長期檢測發(fā)現(xiàn)諸多問題:Bio-Rad CAX為濕柱,柱體積大,吸附容量小,必須采用常壓過柱方式,洗脫液用量大且水占比高,不易濃縮蒸干,實際工作中需要耗費大量的時間和精力,而且Bio-Rad CAX陽離子交換樹脂小柱價格昂貴。本實驗采用PCX干柱,柱體積小,可采用減壓過柱方式,采用0.5%(v/v)甲酸水溶液作為洗脫液,洗脫液用量小,在UPLC-MS/MS靈敏度范圍內,無需濃縮已達到定量限要求,價格低廉,可彌補Bio-Rad CAX柱的缺點。

2.4 實際樣品檢測

采用上述方法檢測837份綠茶、紅茶、青茶、黑茶、白茶、黃茶、代用茶和速溶茶等茶葉樣品,其中草甘膦陽性樣品29份,殘留量在0.140～2.36 mg/kg之間,草銨膦陽性樣品2份,殘留量分別為0.110 mg/kg和0.130 mg/kg,氨甲基磷酸陽性樣品37份,殘留量在0.120～2.15 mg/kg之間。草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸的檢出率分別為3.46%、0.24%和4.42%。按照GB 2763-2016的草甘膦和草銨膦的MRL判定,茶葉樣品草甘膦超標2份,超標率為0.24%,茶葉樣品草銨膦未超標。目前GB 2763-2016尚未制訂氨甲基磷酸的MRL。

3 結論

本文采用正交試驗設計篩選出最優(yōu)前處理方法,以水為提取劑,旋渦提取,PCX強陽離子交換固相萃取干柱凈化,建立了柱前衍生-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定茶葉中草甘膦、草銨膦及其主要代謝物氨甲基膦酸殘留量的實驗方法。該分析方法高效、便捷,價格低廉,可操作性強,方法的靈敏度、精密度和準確度滿足茶葉的日常檢測要求。根據(jù)本實驗現(xiàn)象可知,茶葉豐富的內源性物質對草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸檢測影響較大,茶葉基質的有效去除是排除假陽性樣品的關鍵。基于這一實驗結果,進一步深入探討茶葉內源性成分對草甘膦等除草劑衍生反應的影響,發(fā)現(xiàn)其中的內在規(guī)律,可為提取溶劑和提取方式的選擇、凈化材料的開發(fā)和衍生試劑的選取等提供理論和現(xiàn)實依據(jù)。