張 續(xù), 邱 天, 付 慧, 楊艷偉, 趙 峰, 林少彬, 胡小鍵

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是一類重要的人工合成化學(xué)品,被廣泛添加到各種工業(yè)產(chǎn)品、醫(yī)療器械、食品包裝及個(gè)人護(hù)理品中[1-3]。PAEs已被證明是一類內(nèi)分泌干擾物,具有潛在的生殖毒性、發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性及肝臟毒性[4-6]。流行病學(xué)結(jié)果表明,PAEs暴露與多種疾病相關(guān),如導(dǎo)致幼童生殖器發(fā)育畸形、早熟、增加體重指數(shù)、導(dǎo)致哮喘及過(guò)敏反應(yīng)、增加糖尿病患病率等[7-9]。為此,包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家都對(duì)PAEs的使用進(jìn)行了限制[10]。

我國(guó)是PAEs生產(chǎn)、銷售量大國(guó),消耗量亦呈逐年上漲趨勢(shì)。PAEs在使用過(guò)程中極易遷移至環(huán)境中,目前在我國(guó)大氣、土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)中均有檢出[11-14]。日常生活中,食品、呼吸、飲水、用藥以及護(hù)膚品使用都是攝入PAEs的重要途徑。PAEs在人體內(nèi)的半衰期短,可迅速水解為活性較強(qiáng)的單酯,并進(jìn)一步發(fā)生氧化或羥基化反應(yīng),再經(jīng)葡萄糖醛酸化后經(jīng)尿液排出。因此,美國(guó)、加拿大在其國(guó)家人體生物監(jiān)測(cè)計(jì)劃中,將尿中PAE代謝物作為重要的生物標(biāo)志物,用于評(píng)估PAEs的人體內(nèi)暴露[15,16]。而建立準(zhǔn)確、可靠的分析測(cè)定方法對(duì)于開(kāi)展PAEs暴露評(píng)估十分重要。

在國(guó)外,尿中PAE代謝物測(cè)定主要采用在線固相萃取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法[17,18]。該方法由美國(guó)疾病預(yù)防控制中心建立,并成功用于美國(guó)人體生物監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。近期,國(guó)內(nèi)建立了全自動(dòng)固相萃取串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定10種PAE代謝物的測(cè)定方法[19]。因上述方法的固相萃取裝置在國(guó)內(nèi)普及率不高,導(dǎo)致方法推廣應(yīng)用時(shí)受到一定限制。2011年,本實(shí)驗(yàn)室[20]利用離線固相萃取高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了人尿中11種PAE代謝物的測(cè)定方法。該方法對(duì)鄰苯二甲酸單辛酯(MOP)、鄰苯二甲酸單異癸酯(MDP)和鄰苯二甲酸單異壬酯(MNP)等長(zhǎng)鏈PAEs具有較好保留回收,但對(duì)鄰苯二甲酸單甲酯(MMP)和鄰苯二甲酸單乙酯(MEP)等短鏈PAEs的靈敏度不高,樣品測(cè)定時(shí)受到雜質(zhì)干擾大。但相關(guān)研究[21,22]顯示,人群實(shí)際尿液中的MOP、MDP、MNP等長(zhǎng)鏈PAE代謝物含量檢出率極低。

基于上述研究背景,本文建立了尿中9種常見(jiàn)PAE代謝物的離線固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好,能有效分離多種同分異構(gòu)體,可用于尿液中9種常見(jiàn)PAE代謝物的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acqutiy UPLC-class型高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司); API 4000型三重四極桿質(zhì)譜儀,配電噴霧離子(ESI)源(美國(guó)AB公司);純水儀(美國(guó)頗爾公司);漩渦震蕩儀(美國(guó)Scientific Industries公司);電子天平(美國(guó)丹佛儀器公司)。Waters 0.45 μm GHP濾膜,Waters ACQUITY UPLC BEH Phenyl色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), Waters OASIS MAX固相萃取柱(60 mg, 3 mL)(美國(guó)沃特世公司); Supelco VISIDRY固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)。

MMP、MEP、鄰苯二甲酸單芐酯(MBZP)、鄰苯二甲酸單環(huán)己酯(MCHP)、鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-氧己基)酯(MEOHP)、鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-羥己基)酯(MEHHP)、鄰苯二甲酸單甲酯內(nèi)標(biāo)(MMP-[13C4])、鄰苯二甲酸單乙酯內(nèi)標(biāo)(MEP-[13C4])、鄰苯二甲酸單芐酯內(nèi)標(biāo)(MBZP-[13C4])、鄰苯二甲酸單環(huán)己酯內(nèi)標(biāo)(MCHP-[13C4])、鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-氧己基)酯內(nèi)標(biāo)(MEOHP-[13C4])、鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-羥己基)酯內(nèi)標(biāo)(MEHHP-[13C4])、鄰苯二甲酸單正丁酯內(nèi)標(biāo)(MNBP-[13C4])、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯內(nèi)標(biāo)(MEHP-[13C4]),質(zhì)量濃度均為100 mg/L,純度均大于95%,購(gòu)于美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories。鄰苯二甲酸單異丁酯(MIBP)、鄰苯二甲酸單正丁酯(MNBP)、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP),純度均大于95%,購(gòu)于美國(guó)Accu Standard公司。鄰苯二甲酸單異丁酯內(nèi)標(biāo)(MIBP-[2D4])純度大于98%,購(gòu)于加拿大TRC公司;含MEP、MIBP、MNBP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MBZP的吸煙人群尿中有機(jī)污染物標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)(簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì))購(gòu)于美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(NIST)。

葡萄糖醛酸酶(85 000 U/mL)液體酶和葡萄糖醛酸酶固體酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;乙腈購(gòu)于德國(guó)Merck公司;乙酸銨和甲酸(均為HPLC級(jí))購(gòu)置于美國(guó)CNW公司;乙酸(純度大于99.8%)購(gòu)于美國(guó)Fluka公司;氨水(25%～28%,體積分?jǐn)?shù),下同)購(gòu)于美國(guó)Damas-beta公司;乙酸乙酯(HPLC級(jí))購(gòu)于美國(guó)Fisher公司;純水為純水儀所制超純水,18.2 MΩ·cm。

1.2 溶液配制

準(zhǔn)確稱取MIBP、MNBP、MEHP及MIBP-[2D4]各0.010 0 g,用甲醇定容至10.0 mL。用甲醇稀釋10倍,配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取MMP、MEP、MCHP、MBZP、MIBP、MEOHP、MEHHP和MEHP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL, MNBP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液3.0 mL,用甲醇定容至25.0 mL,配制成9種PAE代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃保存待用,其中MNBP為12.0 mg/L,其余8種物質(zhì)均為4.0 mg/L。

分別取MMP-[13C4]、MEP-[13C4]、MCHP-[13C4]、MBZP-[13C4]、MIBP-[2D4]、MEOHP-[13C4]、MEHHP-[13C4]、MEHP-[13C4]和MNBP-[13C4]內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1.0 mL,用甲醇定容至25.0 mL,配制成4.0 mg/L的9種PAE代謝物內(nèi)標(biāo)使用液,于4 ℃保存。

用甲醇將PAE代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為2.0、1.0、0.5、0.1、0.05和0.01 mg/L標(biāo)準(zhǔn)序列溶液,4 mg/L內(nèi)標(biāo)使用液稀釋為1 mg/L。分別向7支5 mL離心管中加入2 mL人工尿液,加入100 μL上述標(biāo)準(zhǔn)序列溶液、40 μL 1 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液、20 μL葡萄糖醛酸酶、500 μL 1 mol/L乙酸銨溶液(pH=6.5),與樣品一起進(jìn)行前處理后,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、50、100和200 μg/L(MNBP為此曲線質(zhì)量濃度的3倍),內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為40 μg/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件與方法

尿液酶解:冷凍尿液先在4 ℃冰箱中解凍過(guò)夜再放置室溫,充分震蕩后取2 mL,加入500 μL乙酸銨溶液(1 mol/L, pH 6.5),加入40 μL 1 mg/L同位素內(nèi)標(biāo),加入20 μL葡萄糖醛酸酶,充分震蕩后在37 ℃水浴中避光酶解2 h,加入1 mL 25%～28%氨水,充分震蕩后以1 500 r/min的速度離心10 min,取上清進(jìn)行固相萃取。

固相萃取:依次用3 mL乙腈和3 mL純水活化OASIS MAX固相萃取柱,上清液依靠自然重力過(guò)柱(速度保持在1 mL/min);后依次用3 mL水和3 mL乙腈快速淋洗,空氣吹干8 min;用3 mL含2%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)洗脫。洗脫液氮吹近干,用5%乙腈水溶液定容至1 mL,樣品渦旋混勻30 s后過(guò)0.45 μm GHP濾膜,上機(jī)待測(cè)。

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流動(dòng)相A為0.1%乙酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%乙酸乙腈溶液。梯度洗脫:0～14.5 min, 95%A～50%A; 14.5～18.0 min, 50%A～10%A; 18.0～19.0 min, 10%A; 19.0～19.5 min, 10%A～95%A; 19.5～23.0 min, 95%A。流速為0.3 mL/min,柱溫箱溫度為室溫,進(jìn)樣量為10 μL。

離子化方式:ESI-;檢測(cè)方式:多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);碰撞氣(CAD)壓強(qiáng):3.4×104Pa;氣簾氣(CUR)壓強(qiáng):2.1×105Pa;霧化氣(GS1)壓強(qiáng):1.7×105Pa;加熱氣(GS2)壓強(qiáng):2.1×105Pa;噴霧電壓(IS): -4 500 V;去溶劑溫度(TEM): 450 ℃;掃描時(shí)間:50 ms。9種PAE代謝物及對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、離子對(duì)、碰撞電壓(CE)和去簇電壓(DP)等參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理優(yōu)化

2.1.1酶的選擇

以標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)為樣品,比較不添加酶、添加固體酶和添加液體酶3種方式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)包含的7種PAE代謝物測(cè)定值的影響。結(jié)果顯示,添加葡萄糖醛酸酶后PAE代謝物測(cè)定值高于不添加酶的測(cè)定值,說(shuō)明在前處理過(guò)程中對(duì)樣品進(jìn)行去葡萄糖酸基酶解處理十分必要。添加液體酶可獲得與標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)更為接近的測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表2)。因此本文選擇添加液體酶。此外,PAE代謝物在尿中以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)共存。為探討9種PAE代謝物在尿中的不同存在形式,選擇10個(gè)不同來(lái)源的尿液樣品,分別對(duì)其進(jìn)行不加酶和加酶處理,并測(cè)定兩種處理方式下的9種PAE代謝物質(zhì)量濃度C1(不加酶)和C2(加酶)。當(dāng)C1/C2大于0.5時(shí),說(shuō)明該類物質(zhì)主要以游離態(tài)形式存在;當(dāng)C1/C2小于0.5時(shí),則表示該類物質(zhì)主要以結(jié)合態(tài)存在。結(jié)果如圖1所示,MMP、MEP、MBZP在尿液中的存在形式以游離態(tài)為主,而MEHP以結(jié)合態(tài)為主。

表 1 9種鄰苯二甲酸酯(PAE)代謝物及同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

表 2 PAE代謝物標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)在不同酶解方式中的質(zhì)量濃度(n=3)

圖 1 不酶解及酶解處理后尿中8種PAE代謝物的質(zhì)量濃度比值Fig. 1 Ratio of mass concentrations of the eight PAE metabolites in the urine with or without enzymatic treatment C1: mass concentration of the PAE metabolites with enzymatic treatment (μg/L); C2: mass concentration of the PAE metabolites without enzymatic treatment (μg/L). MCHP was not detected.

2.1.2酶解時(shí)間的確定

分別用液體葡萄糖醛酸酶水解標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)1.5、2和24 h,比較酶解時(shí)間對(duì)PAE代謝物測(cè)定結(jié)果的影響。以MEHHP為例,酶解1.5和2 h時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)中MEHHP的質(zhì)量濃度分別為(20.6±0.5)和(23.6±0.8) μg/L。與水解1.5 h相比,水解2 h時(shí)的MEHHP質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)中MEHHP的參考質(zhì)量濃度(24.8±0.40) μg/L更為接近。而在酶解24 h時(shí),MEHHP的質(zhì)量濃度為(23.1±0.96) μg/L,與酶解2 h的質(zhì)量濃度相比差異不顯著。因此本文酶解時(shí)間最終確定為2 h。

2.1.3凈化條件的優(yōu)化

目前用于尿中PAE代謝物凈化處理的固相萃取柱主要有Waters OASIS HLB柱[23]、VARIAN NEXUS柱[20]和Waters OASIS MAX柱[19]。Waters OASIS WAX柱雖未被用于尿中PAE代謝物測(cè)定,但可用于指甲、毛發(fā)中的PAE代謝物前處理凈化[24]。比較了上述幾種常用固相萃取柱對(duì)PAE代謝物的凈化效果。結(jié)果顯示,上述4種固相萃取柱對(duì)9種PAE代謝物均具有較好的保留特性。但Waters OASIS HLB需要兩步凈化,以有效去除尿中的堿性有機(jī)物及鹽成分,操作步驟較為繁瑣[23]。使用VARIAN NEXUS固相萃取柱時(shí),MMP、MEP兩種代謝物的色譜峰較寬,基線不穩(wěn),樣品中目標(biāo)化合物含量低時(shí)色譜峰形差,影響定量結(jié)果。使用Waters OASIS WAX柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理后,收集了上樣和淋洗過(guò)程的過(guò)濾液并上機(jī)測(cè)定,結(jié)果顯示,淋洗液中可檢出目標(biāo)化合物,這表明在前處理過(guò)程中存在目標(biāo)化合物損失。使用同樣方法測(cè)定Waters OASIS MAX柱的上樣及淋洗過(guò)濾液,未見(jiàn)目標(biāo)化合物檢出。洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈?復(fù)溶后上機(jī)測(cè)定,各目標(biāo)化合物均具有較好的色譜峰形。因此,本文選擇Waters OASIS MAX柱對(duì)樣品進(jìn)行固相萃取凈化。

Waters OASIS MAX柱為混合陰離子交換柱,具有陰離子交換和反相吸附兩種模式。因此,向樣品中加入氨水,可促進(jìn)PAE代謝物離子化,增加其在Waters OASIS MAX柱上的保留能力。通過(guò)比較乙腈、甲醇和含2%甲酸的甲醇水溶液(2∶3, v/v)3種不同淋洗液,發(fā)現(xiàn)以3 mL乙腈淋洗后可獲得相對(duì)較好的加標(biāo)回收率。在洗脫液中加入適量甲酸可調(diào)節(jié)Waters OASIS MAX柱pH值,有助于PAE代謝物的洗脫。因此,進(jìn)一步比較了含1%、2%和4%甲酸的乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)的洗脫效果,結(jié)果顯示,用含2%甲酸的乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)洗脫能夠獲得相對(duì)滿意的加標(biāo)回收率。最后比較了不同用量的洗脫液(1～6 mL)對(duì)洗脫效果的影響,確定使用3 mL含2%甲酸的乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)溶液進(jìn)行洗脫。

2.2 液相色譜方法的優(yōu)化

含苯基的硅膠鍵合固定相對(duì)PAE類物質(zhì)具有良好的分離效果。因此,本文比較了CSH Fluoro-Phenyl柱、BEH Phenyl柱和Phenyl柱對(duì)9種PAE代謝物的分離效果。結(jié)果顯示,Phenyl柱對(duì)大部分PAE代謝物分離效率良好,但不能實(shí)現(xiàn)MIBP和MNBP兩種同分異構(gòu)體的分離,其保留時(shí)間接近,色譜圖呈現(xiàn)交叉峰,相互之間影響定量分析。CSH Fluoro-Phenyl柱和BEH Phenyl柱均能實(shí)現(xiàn)PAE代謝物的有效分離。但與BEH Phenyl柱相比,目標(biāo)化合物在CSH Fluoro-Phenyl柱上的保留較長(zhǎng)。在實(shí)際工作中,使用BEH Phenyl柱比CSH Fluoro-Phenyl柱節(jié)約1/3工作時(shí)間。因此,選用BEH Phenyl柱對(duì)9種PAE代謝物進(jìn)行分離。

PAE代謝物是一系列具有極性差異的羧基化合物,在中性或堿性條件下可出現(xiàn)不同程度的解離。因此,在流動(dòng)相中加入適量乙酸可抑制羧酸解離,增強(qiáng)目標(biāo)化合物在色譜柱上的保留。通過(guò)調(diào)研文獻(xiàn)[19,22],本文采用0.1%乙酸水溶液和0.1%乙酸乙腈作為流動(dòng)相,對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行梯度洗脫,以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的有效分離。實(shí)際尿液中,MBP以MIBP和MNBP兩種同分異構(gòu)體狀態(tài)共存,分別代表了不同種類PAE物質(zhì)的暴露。其中MIBP是DIBP(鄰苯二甲酸二異丁酯)的代謝產(chǎn)物,而MNBP是DNBP(鄰苯二甲酸二正丁酯)和BZBP(鄰苯二甲酸二芐基酯)的代謝產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)兩種同分異構(gòu)體的有效分離,可反映出人體受到不同PAEs的暴露情況。在目前國(guó)內(nèi)的研究方法[22,25,26]中,尚未見(jiàn)到能將MIBP和MNBP進(jìn)行有效分離。本文通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序,實(shí)現(xiàn)了MIBP和MNBP的有效分離和精準(zhǔn)定量(見(jiàn)圖2)。

圖 2 9種PAE代謝物在尿液中的提取離子色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the nine PAE metabolites in the urine sample MCHP and MBZP showed spiked (2 μg/L) human urine sample.

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)及定量方法選擇

利用HPLC-MS/MS進(jìn)行復(fù)雜基質(zhì)的污染物測(cè)定時(shí),其復(fù)雜基質(zhì)可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響,因此,在方法建立時(shí)需進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)(ME)評(píng)價(jià)[24]。本方法中,由于無(wú)法獲得不含PAE代謝物的實(shí)際尿液基質(zhì),因此利用人工尿液代替實(shí)際尿液基質(zhì)。分別用人工尿液和乙腈溶液配置兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線,質(zhì)量濃度為0、0.39、0.78、1.57、3.13、6.25、12.5、25、50、100和200 μg/L,將人工尿液配置的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行前處理,與乙腈標(biāo)準(zhǔn)曲線一同上機(jī)測(cè)定,按文獻(xiàn)[27]中基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算方法對(duì)絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示,9種PAE代謝物最終計(jì)算的|ME|范圍為0.81%～15.42%,說(shuō)明絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)良好。在評(píng)估相對(duì)基體效應(yīng)時(shí),選擇了6份不同來(lái)源的實(shí)際尿液,將上述尿液進(jìn)行前處理后,得到6個(gè)不同的尿液基質(zhì)。取490 μL上述尿液基質(zhì),加入10 μL 100 μg/L9種PAE代謝物混合內(nèi)標(biāo)。通過(guò)計(jì)算9種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積,評(píng)估其相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示9種PAE代謝物在不同來(lái)源的尿液基質(zhì)中質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定,峰面積精密度為8.3%,說(shuō)明相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)穩(wěn)定。

基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估結(jié)果顯示,在進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)可用標(biāo)準(zhǔn)曲線代替基質(zhì)匹配工作曲線。然而,本文在利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配工作曲線對(duì)NIST質(zhì)控樣進(jìn)行定量分析時(shí),發(fā)現(xiàn)以人工尿液為基質(zhì)的基質(zhì)匹配工作曲線對(duì)NIST質(zhì)控樣進(jìn)行定量分析更為準(zhǔn)確。雖然基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)中表示基質(zhì)效應(yīng)可忽略,但為獲得更為準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果,本文采用人工尿液基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量計(jì)算。

此外,評(píng)估了外標(biāo)定量法的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)在前處理過(guò)程中出現(xiàn)不同程度的損失,無(wú)法呈現(xiàn)良好線性。而選擇性質(zhì)相似的同位素作為內(nèi)標(biāo),能夠提供準(zhǔn)確的定性和定量信息,校正方法誤差,顯著提高方法的準(zhǔn)確度和精密度。

2.4 線性范圍、方法檢出限和定量限

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程中采用不同的權(quán)重方式會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量結(jié)果造成影響。因此,本文比較了不加權(quán)重、1/x和1/x23種權(quán)重方式對(duì)定量結(jié)果的影響。結(jié)果顯示,以1/x2權(quán)重模式下計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線能更好兼顧低濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn),而高濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)不受影響。這說(shuō)明當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍跨度較大時(shí),在標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)需將權(quán)重方式考慮在內(nèi)。

表 3 9種PAE代謝物回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及線性范圍

Y: relative peak area ratio;X: mass concentration, μg/L.

表 4 尿中9種PAE代謝物在3個(gè)加標(biāo)水平的回收率和精密度(n=6)

* Spiked levels of MNBP were 6, 30 and 150 μg/L.

2.5 回收率及精密度

以實(shí)際尿液進(jìn)行3個(gè)加標(biāo)水平的9種PAE代謝物加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)水平分別為2、10和50 μg/L(MNBP為6、30和150 μg/L),每個(gè)水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn),進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)定。其回收率和精密度結(jié)果如表4所示,9種PAE代謝物的回收率分別為84.1%～122%,精密度為4.5%～14.3%。在同一天及不同天對(duì)實(shí)際尿液樣品進(jìn)行前處理后上機(jī)分析測(cè)定(n=6),以確定方法的日內(nèi)精密度和日間精密度,結(jié)果如表4所示,9種PAE代謝物的日內(nèi)精密度為1.2%～9.3%,日間精密度為2.3%～10.1%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選擇15份人尿樣本,分別在不同保存條件下對(duì)處理的樣本進(jìn)行穩(wěn)定性考察,測(cè)定樣品質(zhì)量濃度與第一天測(cè)定結(jié)果比較,如表5所示,在-20 ℃保存14天后,樣品測(cè)定值為0 h測(cè)定值的91.5%～107%,說(shuō)明樣品可在-20 ℃中保存14天。反復(fù)凍融3次的結(jié)果顯示MMP和MBZP的準(zhǔn)確度與0 h測(cè)定值相比較差,說(shuō)明反復(fù)凍融影響樣品測(cè)定,可能與低濃度物質(zhì)降解或揮發(fā)有關(guān)。

表 5 9種PAE代謝物的穩(wěn)定性(n=15)

ND: not detected.

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

利用本方法測(cè)定50份北京市人群尿液樣本。結(jié)果表明,除MCHP未檢出外,其余8種PAE均可檢出。除MBZP外,其余7種物質(zhì)檢出率為100%,結(jié)果見(jiàn)表6。測(cè)定結(jié)果顯示,人尿中MNBP和MIBP的濃度較高,其中位值分別為219和56.7 μg/L, MEOHP和MEHHP等代謝物處于同一水平,中位值分別為13.3和17.8 μg/L。MMP、MEP和MEHP 3種代謝物存在水平較低,分別為8.90、9.09和6.95 μg/L。上述結(jié)果表明,北京市城市居民存在廣泛的PAE暴露,需引起一定關(guān)注。

表 6 PAE代謝物在人尿中的測(cè)定值

P25-P70: mass concentration of PAE metabolites from 25th to 70th percentile. ND: not detected.

3 結(jié)論

本文建立了測(cè)定人尿液中9種PAE代謝物的UPLC-MS/MS分析方法?？疾炝嗣傅姆N類、酶用量、酶解時(shí)間和凈化過(guò)程等,采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。本方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果可靠,檢出限低,重現(xiàn)性好,已應(yīng)用于生物樣本的檢測(cè),為今后開(kāi)展人體生物監(jiān)測(cè)項(xiàng)目奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。