孟志娟, 黃云霞, 趙麗敏, 孫文毅, 范素芳*, 李 強*, 潘燦平

(1. 河北省食品檢驗研究院, 河北省食品安全重點實驗室, 河北 石家莊 050091; 2. 中國農(nóng)業(yè)大學理學院, 北京 100193)

食品安全問題是當今世界面臨的重大問題,而農(nóng)藥殘留是影響食品安全的重要因素之一。目前全球已注冊的農(nóng)藥超過2 000余種,其中常用的約500種。農(nóng)藥的施用在保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的同時也對生態(tài)環(huán)境造成一定程度的污染,特別是農(nóng)藥的濫用在破壞環(huán)境的同時也威脅到人類健康。為保護消費安全,各國家和地區(qū)都制定了農(nóng)藥最大殘留限量標準。因此,為控制農(nóng)藥殘留、保證食用者安全和避免貿(mào)易爭端,發(fā)展快速、可靠、靈敏和實用的農(nóng)藥殘留分析技術(shù),建立快速篩查農(nóng)藥殘留的方法顯得尤為重要[1-5]。

農(nóng)藥殘留分析是一項復雜的痕量分析技術(shù),而傳統(tǒng)的提取凈化技術(shù)已遠遠滿足不了現(xiàn)代農(nóng)藥殘留分析的要求,更快速、高效的前處理技術(shù)隨之產(chǎn)生。QuEChERS方法由2003年美國農(nóng)業(yè)部率先提出,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和歐盟共同參與開發(fā)的一種對水果、蔬菜中多農(nóng)藥殘留提取和凈化的方法,采用硫酸鎂鹽析分層和分散固相萃取凈化。隨后,美國官方分析化學師協(xié)會認證的方法(AOAC 2007.01)引用了乙酸緩沖鹽提取體系[6]；歐洲標準化委員會認證的歐盟標準方法(EN 15662-2008)，采用檸檬酸緩沖鹽提取體系[7],以上方法均是在QuEChERS的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。目前QuEChERS方法已用于枸杞、生菜、橙子等水果和蔬菜中200多種農(nóng)藥殘留的檢測[8,9]。

為了提高檢測效率和回收率,國內(nèi)外研究者對QuEChERS方法開展了多種改進研究,如向提取溶劑中加入緩沖鹽、選擇合適的提取溶劑和新型的凈化材料等[10-13]。Tomasini等[14]采用改良的QuEChERS方法對蜂蜜中的8種殺蟲劑殘留進行同時測定,實驗中加入氨水調(diào)節(jié)pH值,使體系呈弱堿性,回收率為86.7%～107%, RSD<20%;金芬等[15]同時測定了水果中19種酸性農(nóng)藥,結(jié)果證明采用乙酸-乙腈(1∶99, v/v)提取多農(nóng)藥殘留效果最好,可以顯著改善不穩(wěn)定農(nóng)藥的回收率。Zhao等[16]用多壁碳納米管材料(MWCNTs)替代乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)作為凈化劑,測定蔬菜和水果中30種農(nóng)藥殘留,結(jié)果顯示回收率在71%～110%之間,RSD<15%。

SinChERS-Nano分散基質(zhì)固相萃取柱是基于QuEChERS開發(fā)的一種新型快速樣品前處理的凈化柱。通過優(yōu)化的柱體結(jié)構(gòu)與改良的多壁碳納米材料相結(jié)合,可以避免樣品凈化過程中溶劑轉(zhuǎn)移所造成的損失,同時去除基質(zhì)中的干擾成分,大大節(jié)省了樣品制備時間。目前關(guān)于SinChERS-Nano柱結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)的相關(guān)研究尚未見報道。本實驗建立了SinChERS-Nano柱凈化結(jié)合GC-MS/MS檢測水果中常見的50種農(nóng)藥殘留的分析方法,能夠?qū)λ卸噢r(nóng)藥殘留進行篩查分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQTM8000氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司); DB-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國Agilent公司); 3K15型高速冷凍離心機(德國Sigma公司); 0.22 μm微孔濾膜(天津艾杰爾公司)。

乙腈(色譜純,德國Merck公司); QuEChERS凈化離心管,包括100.0 mg PSA和50.0 mg MgSO4(美國Thermo公司); SinChERS-Nano柱,包括2 g NaSO4、0.6 g MgSO4、90 mg PSA和15 mg MWCNTs(北京綠綿科技有限公司);普通鹽包(無緩沖鹽),包括4 g MgSO4和1 g NaCl(美國Thermo公司);乙酸緩沖鹽體系鹽包,包括6 g MgSO4和1.5 g醋酸鈉(北京綠綿科技有限公司);檸檬酸緩沖鹽體系鹽包,包括4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉(北京綠綿科技有限公司)。

50種農(nóng)藥標準品及內(nèi)標環(huán)氧七氯均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所(質(zhì)量濃度均為100 mg/L)。用乙腈配制10 mg/L的農(nóng)藥混合標準溶液和10 mg/L內(nèi)標環(huán)氧七氯標準溶液,置于-18 ℃儲存。

實驗用柑橘、葡萄、蘋果、梨、草莓、獼猴桃、櫻桃、棗、桃、杏均購于當?shù)爻小?/p>

1.2 樣品前處理

1.2.1提取

方式一:分別稱取已勻漿的柑橘和葡萄樣品10.0 g(精確到0.001g),置于50 mL塑料離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋1 min,加入普通鹽包,渦旋1 min,以9 000 r/min離心5 min。

方式二:分別稱取已勻漿的柑橘和葡萄樣品15.0 g(精確到0.001 g),置于50 mL塑料離心管中,加入15 mL乙腈,渦旋1 min,加入乙酸緩沖鹽體系鹽包,渦旋1 min,以9 000 r/min離心5 min。

方式三:除加入檸檬酸緩沖鹽體系鹽包外,其他操作同方式一。

1.2.2凈化

PSA凈化:移取2 mL提取上清液至QuEChERS凈化離心管中,振蕩混合1 min,以9 000 r/min離心3 min,吸取上清液,過0.22 μm濾膜,待GC-MS/MS分析。

SinChERS-Nano柱凈化:取SinChERS-Nano柱,置于盛有提取液的50 mL離心管內(nèi),緩慢下壓至刻度處(儲液池內(nèi)凈化液4 mL)，用注射器吸取上清液，過0.22 μm濾膜,待GC-MS/MS分析。

按照上述提取、凈化步驟制得柑橘和葡萄空白提取液。

1.3 標準溶液的配制

將10 mg/L 50種農(nóng)藥混合標準溶液用柑橘和葡萄的空白提取液稀釋,配制成0.1 mg/L和2 mg/L的基質(zhì)標準溶液;用柑橘和葡萄的空白提取液配制質(zhì)量濃度分別為0.005、0.02、0.05、0.1和0.2 mg/L的系列混合基質(zhì)標準溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

Agilent HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度:250 ℃;升溫程序:初始溫度80 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升溫至150 ℃,再以3 ℃/min升溫至210 ℃,最后以10 ℃/min升溫至290 ℃,保持20 min;載氣:氮氣(純度≥99.999%),流速:1.0 mL/min;進樣方式:不分流進樣,進樣體積:1 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:280 ℃;傳輸線溫度:300 ℃;電子能量:70 eV。采用AutoSRM軟件對質(zhì)譜參數(shù)進行分析。50種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 50種農(nóng)藥的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)

表 1 (續(xù))

CE: collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方式的選擇

本實驗選擇柑橘和葡萄基質(zhì),采用PSA凈化,考察了普通鹽包、乙酸緩沖鹽體系鹽包和檸檬酸緩沖鹽體系鹽包對提取效果的影響。分別在10、50和150 μg/kg 3個添加水平下進行加標回收試驗,每個添加水平重復測定6次。樣品在提取過程中,基質(zhì)pH值會影響某些農(nóng)藥的回收率。柑橘和葡萄都屬于酸性基質(zhì),對酸敏感的農(nóng)藥回收率較低。通過對農(nóng)藥回收率的研究,發(fā)現(xiàn)甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、三氯殺螨醇、百菌清5種農(nóng)藥,采用普通鹽包提取時,回收率為54%～132%,相對標準偏差為10%～30%;采用乙酸緩沖鹽體系鹽包和檸檬酸緩沖鹽體系鹽包時,回收率為70%～130%,相對標準偏差<15%。其余農(nóng)藥采用3種提取方式時回收率為80%～120%,相對標準偏差<15%。說明建立緩沖體系的鹽包均能控制有機相的酸堿度,改善對酸敏感的農(nóng)藥的回收率,提取效果優(yōu)于普通鹽包。兩種緩沖鹽體系鹽包無明顯差別,后續(xù)試驗采用乙酸緩沖鹽體系鹽包提取。

2.2 凈化方式的選擇

實驗比較了PSA凈化和SinChERS-Nano柱凈化的凈化效果(見圖1和圖2)。從圖1中可以看出,不論是柑橘樣品還是葡萄樣品,采用PSA凈化時樣品顏色較深；采用SinChERS-Nano柱凈化時樣品顏色透明。從圖2可以看出,PSA凈化后樣品雜質(zhì)多,干擾大,而SinChERS-Nano柱凈化后樣品雜質(zhì)少，受干擾小。

圖 1 采用PSA與SinChERS-Nano柱凈化后柑橘和 葡萄樣品的凈化效果圖Fig. 1 Purification effect maps of citrus and grape samples cleaned-up by primary secondary amine (PSA) and SinChERS-Nano column

圖 2 加標(0.02 μg/kg)柑橘和葡萄經(jīng)PSA凈化與 SinChERS-Nano凈化后的總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of the spiked (0.02 μg/kg) citrus and grape samples cleaned-up by PSA and SinChERS-Nano

兩種凈化方式中起主要作用的PSA為弱離子交換的固相萃取材料,用來去除色素、有機酸及一些糖類和脂肪酸。SinChERS-Nano柱中除PSA外,還添加了一定量的MWCNTs。MWCNTs是中密度纖維材質(zhì),比表面積大,具有良好的吸附能力,也能夠有效去除色素等雜質(zhì),且凈化效果更好[17-21]。實驗表明,PSA和MWCNTs的配合使用能有效清除水果中的雜質(zhì),減少對目標物的干擾,同時能延長襯管的使用壽命和減少離子源的污染。因此后續(xù)凈化采用SinChERS-Nano柱凈化。

2.3 基質(zhì)效應

質(zhì)譜分析測定中基質(zhì)效應的存在會影響定量分析結(jié)果的準確性和重復性[22]。水果中含有大量有機酸、糖類、色素等不易揮發(fā)性物質(zhì),這些物質(zhì)的存在會影響目標農(nóng)藥的離子化[23]?；|(zhì)效應的相對強度(ME)=(基質(zhì)標準溶液的峰面積/溶劑標準溶液的峰面積)×100%[24]。本實驗對50種農(nóng)藥的基質(zhì)效應進行了考察,結(jié)果顯示,柑橘和葡萄樣品中40%的目標物的ME在100%～120%之間,剩余目標物的ME>120%,均表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應。因此本實驗采用空白基質(zhì)溶液進行標準曲線配制,以減小基質(zhì)效應對目標化合物測定結(jié)果的影響。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

用空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為0.005～0.2 mg/L的系列混合標準溶液,在1.4節(jié)條件下進行分析,以各化合物的峰面積為縱坐標、對應的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明,50種農(nóng)藥在0.005～0.2 mg/L范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)均>0.995 0(見表2)。以信噪比(S/N)約為3和10時空白樣品添加濃度計算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果分別為0.3～3.0 μg/kg和1.0～10.0 μg/kg(見表2),均符合國內(nèi)外法規(guī)的相關(guān)殘留限量要求[25-26]。

2.5 回收率與精密度

在空白柑橘和葡萄樣品中添加3個水平(10、50和150 μg/kg)的50種農(nóng)藥混合標準溶液進行加標回收試驗,每個添加水平重復測定6次。結(jié)果表明,其中45種農(nóng)藥的回收率為79.1%～122.3%,相對標準偏差(RSD)低于12.2%。甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、三氯殺螨醇、百菌清這5種農(nóng)藥的回收率為71.2%～129.2%,相對標準偏差(RSD)低于13.9%(見表2)。

2.6 實際樣品檢測

用所建方法對市售的10種水果(柑橘、葡萄、蘋果、梨、草莓、獼猴桃、櫻桃、棗、桃、杏)共50例樣品進行測定,檢出率達30%,其中草莓和葡萄樣品中農(nóng)藥的檢出率較高,檢出頻率較高的農(nóng)藥為腐霉利、氟蟲腈、甲拌磷、氯氰菊酯、氧化樂果,但均未超過最大殘留限量。

3 結(jié)論

本實驗采用SinChERS-Nano柱進行樣品前處理,結(jié)合GC-MS/MS,建立了水果中50種農(nóng)藥的快速定性定量分析的方法,并運用所建方法檢測了包括柑橘和葡萄在內(nèi)的10種水果樣品。該法具有操作簡單、快速高效和準確可靠等優(yōu)點,能夠?qū)θ粘４罅克麡悠分卸噢r(nóng)藥殘留進行快速篩查。