辛燕花，張鐵丹，劉陽(yáng),張建華，連廣平

(1.忻州師范學(xué)院 生物系,山西 忻州 034000； 2.萬(wàn)物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司,廣東 廣州 510642)

靈芝[Ganodermalucidum] 是一種歷史悠久，具有多種生理調(diào)節(jié)功能的珍貴食藥用菌[1]。靈芝可以保護(hù)肝臟，抗腫瘤，抗艾滋病病毒及艾滋病病毒的蛋白酶活性，影響組織胺的釋放，抑制血管緊張素的形成，對(duì)人體的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)等[2～3]。陳皮是一種經(jīng)曬干或干燥后的果皮，多為蕓香科植物的成熟果實(shí)。橙皮苷是陳皮中的主要成分之一，有較強(qiáng)的生理調(diào)節(jié)功能，如抗脂質(zhì)氧化、抗病毒、抗癌、延緩衰老等[4]。雪梨含有多糖和多種酯類(lèi)等物質(zhì)，因此具有多種生理調(diào)節(jié)功能[5]。

近年來(lái)，靈芝相關(guān)產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)越來(lái)越多，主要得益于其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。對(duì)于以靈芝為原料研發(fā)的發(fā)酵型飲料在市場(chǎng)不常見(jiàn)，研究較為緩慢滯后。有研究者通過(guò)添加豆渣發(fā)酵靈芝菌絲體得到的發(fā)酵液制備的果汁色澤和組織形態(tài)較好，但口感較粗糙[6]。還有一些靈芝飲料多數(shù)直接采用子實(shí)體為原料進(jìn)行生產(chǎn)，導(dǎo)致靈芝本身的營(yíng)養(yǎng)成分和生理功能并沒(méi)有全部被開(kāi)發(fā)出來(lái)。研究表明，相比其他飲料，發(fā)酵型的食用菌功能飲料有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)深層發(fā)酵后的食用菌功能飲料保留了原有食用菌的生理調(diào)節(jié)功效，并且在發(fā)酵過(guò)程中這種大型的真菌分解出的酶可以促進(jìn)許多新的風(fēng)味物質(zhì)的形成[7～9]。因此，開(kāi)發(fā)新型發(fā)酵型食用菌功能飲料具有廣闊的前景。

本文選用靈芝為出發(fā)菌株，以具有抗氧化性功效的中草藥陳皮及口感較好的雪梨為培養(yǎng)基，添加檸檬酸及低糖的木糖醇進(jìn)行混合發(fā)酵靈芝，對(duì)所得的復(fù)合型飲料以感官評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)一步對(duì)該復(fù)合飲料的活性物質(zhì)及抗氧化性進(jìn)行分析，為研究發(fā)酵型飲料提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝菌種購(gòu)于山東冠縣靈芝基地；陳皮、雪梨市售。木糖醇(食品級(jí))購(gòu)于河南鄭州雙騰實(shí)業(yè)有限公司；檸檬酸(食品級(jí))購(gòu)于億巖生物科技股份責(zé)任制有限公司；熊果酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于廣東廣州國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)商城。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

350G小型超細(xì)食品電動(dòng)磨粉機(jī)(浙江萬(wàn)基塑業(yè)有限公司)；UV-6100H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美普達(dá)科學(xué)分析儀器有限公司)；JJ224BC電子天平(上?；ǔ备呖茖?shí)驗(yàn)儀器有限公司)；TDZ5WSB低速自動(dòng)離心機(jī)(太原邁達(dá)儀器有限公司)；DKZ-2電熱恒溫振蕩水槽(太原邁達(dá)儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合飲料研制的工藝流程

PDA液體培養(yǎng)基復(fù)配雪梨、陳皮、木糖醇、檸檬酸接種靈芝→發(fā)酵→粗濾→高溫滅菌→冷卻成品。

1.3.2 工藝說(shuō)明

1.3.2.1 陳皮汁制備

稱(chēng)取適量陳皮按料液比1∶30(g·mL-1，質(zhì)量體積比)配制，沸水浴浸提兩次，每次1 h，紗布過(guò)濾后冷藏備用。

1.3.2.2 雪梨汁制備

將雪梨清洗干凈后進(jìn)行削皮去核并切塊，按料液比1∶2的比例榨汁后，紗布過(guò)濾，制成溶液，冷藏備用。

1.3.2.3 發(fā)酵

將1.3.2.1中活化的靈芝菌種按接種量為0.1%的接入含有陳皮汁，雪梨汁，木糖醇和檸檬酸的PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，得到的發(fā)酵產(chǎn)物多次過(guò)濾除雜，經(jīng)4 ℃、10 000 rpm離心后，取上清，得到最終的復(fù)合飲料，120 ℃滅菌 30 min，迅速冷卻至室溫。

1.3.3 復(fù)合飲料的單因素試驗(yàn)試驗(yàn)

1.3.3.1 陳皮雪梨比例

在50 mL PDA液體培養(yǎng)基中分別添加總量為20 mL不同體積比例的陳皮雪梨混合液(陳皮：雪梨為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1)混合均勻，以不添加雪梨、陳皮為對(duì)照，在28 ℃，150 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)7 d。其他變量按最小量添加(木糖醇的含量為4 g·100 mL-1，檸檬酸為0.04 g·100 mL-1)觀(guān)察靈芝菌絲生長(zhǎng)情況，各3組平行試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)分。

1.3.3.2 陳皮雪梨添加量

設(shè)定陳皮汁與雪梨汁的體積比為1∶3，木糖醇的含量為4 g·100 mL-1，檸檬酸為0.04 g·100 mL-1，陳皮雪梨汁添加量為60%、50%、40%、30%和20%,5個(gè)梯度下混合發(fā)酵靈芝，各3組平行試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)分。

1.3.3.3 木糖醇添加量

設(shè)定陳皮汁與雪梨汁的體積比為1∶3，陳皮雪梨汁添加量為40%，檸檬酸為0.04 g/100 mL分別在木糖醇含量為3、4、5、6、7、8 g·100 mL-1的為5個(gè)梯度下混合發(fā)酵靈芝，各3組平行試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)分。

1.3.3.4 檸檬酸添加量

設(shè)定陳皮汁與雪梨汁的體積比為1∶3，陳皮雪梨汁添加量為40%，木糖醇為4 g/100 mL，分別在檸檬酸含量為0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 g/100 mL的5個(gè)梯度下混合發(fā)酵靈芝，各3組平行試驗(yàn)試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)分。

1.3.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合飲料

以產(chǎn)品感官品分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)復(fù)合飲料調(diào)配的陳皮雪梨比例、陳皮雪梨添加量、木糖醇添加量、檸檬酸添加量進(jìn)行響應(yīng)面分析(表1)，確定最優(yōu)組合。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表

Table1 Factors and their levels of response surface design

因素Factors編碼水平Levels-101A陳皮雪梨比例 Proportion of tangerine peel and pear1∶21∶31∶4B陳皮雪梨添加量 Adding amount of tangerine peel and pear30 %40 %50 %C木糖醇含量/g·100 mL-1The content of xylitol 345D檸檬酸含量/g·100 mL-1The content of citric acid0.100.120.14

1.3.4 復(fù)合飲料的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

復(fù)合飲料殺菌后，由30名品評(píng)員組成感官評(píng)價(jià)小組(男女各15人)對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)分，每次評(píng)分前用溫開(kāi)水漱口。感官評(píng)價(jià)參考文獻(xiàn)進(jìn)行[10]，見(jiàn)表2。

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定

可溶性固形物采用折光法測(cè)定[11]；采用精密酸度計(jì)對(duì)飲料pH 值進(jìn)行測(cè)定。多糖的提取參考文獻(xiàn)進(jìn)行[12]，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=1.041 4x，R2為0.999 6，R2=0.999 1。總?cè)频奶崛⒖嘉墨I(xiàn)進(jìn)行[13]，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=0.140 8x+0.002 6，R2=0.999 1。

1.3.6 抗氧化性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)進(jìn)行[14]。其中，靈芝發(fā)酵液抗氧化性的測(cè)定直接測(cè)定發(fā)酵原液。

1.3.7 微生物指標(biāo)檢測(cè)

參照 GB 7101-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲料》方法檢驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，均值之間的顯著性差異采用Duncan′s Multiple

表2 復(fù)合飲料感官評(píng)價(jià)表Table 2 Criteria for sensory evaluation of compound beverage

Range Test進(jìn)行檢驗(yàn)對(duì)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 陳皮雪梨比影響因素

從圖1可以看出，不同體積陳皮雪梨比對(duì)復(fù)合飲料的口感有一定的影響，當(dāng)陳皮雪梨體積比為1∶3的時(shí)候，感官評(píng)價(jià)得分最高，因此選擇陳皮雪梨的最佳比例為1∶3。

2.1.2 陳皮雪梨添加量影響因素

從圖2可以看出，隨著陳皮雪梨添加量的增加，感官評(píng)分也在逐漸增高，當(dāng)達(dá)到40%時(shí)，評(píng)分最高，在40%以后，隨著陳皮雪梨添加量的增加，評(píng)分降低，表明復(fù)合飲料在此條件下，效果最佳。

2.1.3 木糖醇添加量影響因素

圖1 陳皮雪梨體積比對(duì)復(fù)合飲料感官性狀的影響Fig.1 Effect of tangerine peel and pear volume ratio on the sensory score of clarified compound beverage

圖2 陳皮雪梨添加量對(duì)感官性狀的影響Fig.2 Effect of adding amount of tangerine peel and pear on the sensory score of clarified compound beverage

圖3 木糖醇添加量對(duì)性狀評(píng)價(jià)的影響Fig.3 Effect of adding amount of newtol on the sensory score of clarified compound beverage

從圖3可以看出，感官評(píng)分隨著木糖醇含量的 增加而增高，在4 g/100 mL時(shí)，評(píng)分最高，當(dāng)高于或者低于4 g/100 mL時(shí)，評(píng)分依次降低，木糖醇含量過(guò)高或過(guò)低，均會(huì)影響口感，感官評(píng)價(jià)均較差。

2.1.4 檸檬酸添加量影響因素

由圖4可知，隨著木糖醇含量的增加，感官評(píng)分也在增高，當(dāng)檸檬酸添加量為0.12 g/100 mL時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高，表明檸檬酸含量在0.12 g/100 mL時(shí)效果最佳，產(chǎn)品酸甜可口，品質(zhì)較好。

圖4 檸檬酸添加量對(duì)感官性狀的影響Fig.4 Effect of adding amount of citric acid on the sensory score of clarified compound beverage

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

通過(guò)單因素試驗(yàn)得出，陳皮雪梨比例為1∶3、陳皮雪梨汁添加量為40 %、木糖醇含量為4 g/100 mL、檸檬酸含量為0.12 g/100 mL時(shí)效果最佳，以飲料的感官得分為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面的分析試驗(yàn)，如下表3。

對(duì)上表的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到以下四元二次方程：

Y=96.667+0.000 A-1.176B-0.667C+1.381D-7.079 A×A-8.592B×B-6.329C×C-4.843D×D-1.000 A×B-0.250 A×C+0.750 A×D-0.750B×C+0.892B×D-0.500C×D

對(duì)表3的設(shè)計(jì)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到響應(yīng)面回歸模型的系數(shù)顯著性可見(jiàn)4因素3水平方差分析結(jié)果由表4可知。

如表5所知，本試驗(yàn)所用的二次模型的極顯著性(P<0.01)顯著(P<0.05)，可見(jiàn)陳皮雪梨添加量(B)、檸檬酸含量(D)以及A2、B2、C2、D2對(duì)感官得分有非常顯著的影響P<0.01，木糖醇含量(C)對(duì)其也有較顯著的影響p<0.05，這些說(shuō)明試驗(yàn)因素對(duì)感官得分的影響不是所謂的線(xiàn)性關(guān)系，同時(shí)也可以得知研究的幾個(gè)單因素對(duì)感官得分影響的程度依次為：檸檬酸含量>陳皮雪梨添加量>木糖醇含量>陳皮雪梨比例。由表4所顯示的分析結(jié)果所示，本試驗(yàn)所用方差分析模型顯著性P<0.000 1為極顯著，而失擬項(xiàng)P=0.260>0.05為不顯著，說(shuō)明模型對(duì)實(shí)踐的擬合程度很好，對(duì)現(xiàn)實(shí)生活有非常好的指導(dǎo)作用。同時(shí)也意味著此所模擬的實(shí)踐中的四因素三水平是可靠的，可以運(yùn)用所得到的回歸方程對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)模擬分析，從而得到開(kāi)發(fā)靈芝陳皮雪梨飲料的最好條件。通過(guò)對(duì)回歸方程的降維分析來(lái)探討任意兩個(gè)因素是否同時(shí)影響復(fù)合飲料的口味，結(jié)果如圖5所示。

表3 陳皮雪梨發(fā)酵靈芝復(fù)合飲料最佳配方工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

由圖5等高線(xiàn)可以看出檸檬酸含量與陳皮雪梨比例(圖5c)、檸檬酸含量與陳皮雪梨添加量(圖5e)組合對(duì)復(fù)合飲料的口味的影響較大。當(dāng)陳皮雪梨比例和陳皮雪梨添加量一定時(shí)，感官得分隨著檸檬酸含量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

2.3 最佳條件的確定以及驗(yàn)證試驗(yàn)分析

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得到通過(guò)計(jì)算得出陳皮雪梨比例為0.38，陳皮雪梨汁添加量為41%，檸檬酸的用量為0.11 g/100 mL，木糖醇的用量為3.94 g/100 mL預(yù)期感官得分為96.358 4，在這樣的條件下飲料達(dá)到最優(yōu)，但考慮到實(shí)際問(wèn)題將試驗(yàn)條件修改為為陳皮雪梨比例為1∶3，陳皮雪梨汁添加量為60%、50%、40%、30%和20%， 5個(gè)梯度下混合發(fā)酵靈芝，各3組平行試驗(yàn)，對(duì)發(fā) 酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)分。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

注：**為極顯著：*為顯著。

Note:**Extremely striking contrast，*Striking contrast.

注：**為極顯著：*為顯著。

Note：**Extremely striking contrast，*Striking contrast.

2.4 理化指標(biāo)檢測(cè)

經(jīng)測(cè)定，可溶性固形物為含量117.3 mg·mL-1、pH5.25～5.75。在最優(yōu)組合下，對(duì)陳皮雪梨發(fā)酵靈芝復(fù)合飲料中的活性物質(zhì)和抗氧化性進(jìn)行測(cè)定后，結(jié)果如下(表6、表7)。

加量為40%，檸檬酸的用量0.11 g/100 mL，木糖醇的用量為4 g/100 mL按照此提取條件進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，得到的飲料顏色純凈自然，有清新的陳皮味，并且伴有靈芝特有的味道，酸甜適中，感官得分為96，與理論值96.358 4相對(duì)照，相對(duì)差值為0.358 4，從而充分證明響應(yīng)面分析對(duì)實(shí)踐具有非常有效的指導(dǎo)意義。

從表6可以看出，靈芝陳皮發(fā)酵靈芝的復(fù)合飲料中含有活性物質(zhì)多糖和總?cè)苹衔?，并且多糖和總?cè)频暮扛哂陟`芝發(fā)酵液中多糖和三萜的含量。從表7可以看出，該復(fù)合飲料具有一定的氧化性，羥自由基清除率為16.27%，還原力為0.23，均高于靈芝發(fā)酵原液。

圖5 各兩因素交互作用對(duì)飲料感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of various ingredients on the sensory score of beverage

Table6 Active ingredient of compound beverage under the optimal combination

檢測(cè)指標(biāo)Active ingredient mg·mL-1對(duì)照(靈芝發(fā)酵液)Control (Ganoderma lucidumfermentation broth)復(fù)合飲料Compound beverage多糖Polysaccharide137.80±0.08a152.44±0.07b總?cè)芓otal triterpenes83.36±0.0.06a92.09±0.08b

注：數(shù)據(jù)右上角標(biāo)注的字母表示不同處理的同一指標(biāo)在0.05水平上的顯著差異性。

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.05 level in the same row.

2.5 微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)<100 cfu/mL，大腸桿菌< 6 MPN/100 mL，致病菌未檢出。

表7最優(yōu)組合下復(fù)合飲料的抗氧化性能

Table7 Anti-oxidative properties of compound beverage under the optimal combination

檢測(cè)指標(biāo)Active ingredient 對(duì)照(靈芝發(fā)酵液)Control (Ganoderma lucidum fermentation broth)復(fù)合飲料Compound beverage羥自由基清除率/%13.52%±0.18a16.27%±0.18b還原力 (OD)0.11±0.17a0.23±0.18b

注：數(shù)據(jù)右上角標(biāo)注的字母表示不同處理的同一指標(biāo)在0.05水平上的顯著差異性。

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.05 level in the same row

3 討論

本研究?jī)?yōu)化后得到的陳皮雪梨發(fā)酵靈芝的復(fù)合飲料具有一定的抗氧化性，且抗氧化性能高于靈芝發(fā)酵液中。對(duì)復(fù)合飲料中的活性物質(zhì)多糖和總?cè)频暮扛哂陟`芝發(fā)酵液中的含量，推測(cè)引起這種變化的原因，可能是在發(fā)酵液中靈芝會(huì)吸收陳皮雪梨中的某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為合成多糖和某些抗氧化活性物質(zhì)的原料，其次，靈芝發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶會(huì)水解陳皮雪梨中細(xì)胞壁上的纖維素和木質(zhì)素等，可引起多糖等物質(zhì)的釋放；除此之外，微生物在發(fā)酵過(guò)程中的生物轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)致其他成分可能轉(zhuǎn)化為多糖類(lèi)物質(zhì)。

大分子物質(zhì)會(huì)被靈芝生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酶類(lèi)水解，有研究表明，靈芝胞外三萜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有較好的抑菌作用[15～17]。本研究制備的陳皮雪梨發(fā)酵型功能飲料含有較高的三萜類(lèi)化合物，可以進(jìn)一步探討該飲料的抑菌及其他生理調(diào)節(jié)功能。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化陳皮雪梨發(fā)酵靈芝最佳配方，通過(guò)模型回歸分析得到在試驗(yàn)范圍內(nèi)存在最大值，100 mL發(fā)酵復(fù)合飲料的最佳配方比為陳皮雪梨汁40%，體積比1∶3，檸檬酸0.11 g，木糖醇4 g。該復(fù)合飲料中的多糖含量為152.44 mg·mL-1，總?cè)坪繛?2.09 mg·mL-1，與靈芝發(fā)酵原液相比，羥自由基清除率為16.27%，還原力為0.23，具有一定的抗氧化性。