曹燕篆，張建偉，閆雙堆

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，山西 太谷 030801)

秸稈是世界上最豐富的木質(zhì)纖維素資源，同時(shí)也是主要的農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物，全世界每年可產(chǎn)生近20億噸秸稈，我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈產(chǎn)量每年可達(dá)7億多噸，占世界秸稈資源產(chǎn)量的25%左右[1～2]，秸稈的綜合利用對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)穩(wěn)定、農(nóng)民增收及緩解能源環(huán)境壓力具有重要作用[3]。中國(guó)是世界上谷子種植面積最大的國(guó)家之一，近年來(lái)，隨著谷子的抗旱節(jié)水特性、營(yíng)養(yǎng)保健功能及產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值逐漸被人們重新認(rèn)識(shí)，種植面積持續(xù)擴(kuò)大，隨之而來(lái)的是產(chǎn)量可觀的谷子秸稈[4]，但目前對(duì)谷子秸稈的資源轉(zhuǎn)化研究較少。

谷子秸稈主要由木質(zhì)纖維素組成，化學(xué)成分復(fù)雜，物理結(jié)構(gòu)致密，對(duì)微生物的分解具有抵抗作用。分解效率低成為限制秸稈資源高效利用的瓶頸，因此多種不同的預(yù)處理方式被提出，其中NaOH處理是一種最常見(jiàn)的預(yù)處理方式，能夠有效去除木質(zhì)素并破壞結(jié)晶結(jié)構(gòu)從而增加纖維素接觸面積[5,6]。大量的研究表明，秸稈等天然木質(zhì)纖維素材料經(jīng)過(guò)不同濃度的NaOH預(yù)處理后能夠顯著提高水解效率，獲得更多的還原糖、甲烷產(chǎn)量等[7,8]。然而，大量廢液的產(chǎn)生需要處理，降低了秸稈資源化經(jīng)濟(jì)效益，若處理不當(dāng)則會(huì)造成環(huán)境污染問(wèn)題。生物預(yù)處理由于具有成本低、環(huán)境友好、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，成為目前研究的熱點(diǎn)[9]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)微生物菌群比單個(gè)菌株具有更好的木質(zhì)纖維素分解能力[10]。本研究利用已經(jīng)篩選獲得的一組能夠有效分解多種木質(zhì)纖維素材料的菌群MC1，其組成主要包括Clostridium straminisolvens CSK1，Clostridium sp. FG4, Pseudoxanthomonas sp. M1-3，Brevibacillus sp. M1-5及 Bordetella sp. M1-6[11]，比較對(duì)NaOH處理及未經(jīng)任何前處理谷子秸稈的分解特性，研究MC1對(duì)谷子秸稈的分解潛力，對(duì)我國(guó)谷子秸稈的資源化利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：菌群MC1由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院廢棄物資源利用研究室提供[12]。

谷子秸稈：取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)站。一部分用1% NaOH浸泡24 h清水沖洗至pH中性，60 ℃烘干至恒重備用(堿處理秸稈AT)，另一部分直接烘干備用(未處理秸稈NT)，秸稈木質(zhì)纖維素組成見(jiàn)表 1。

表 1 秸稈樣品組成成分Table 1 Components of millet straw samples

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

復(fù)合菌系MC1的活化及培養(yǎng)使用PCS培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，去離子水1 L，pH 7.0。將200 mL的培養(yǎng)液加入到300 mL的三角瓶中，添加1%的谷子秸稈作為唯一碳源，121 ℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫，接種MC1進(jìn)行分解試驗(yàn)，接種量為5 % v/v，接種后置于50 ℃靜置培養(yǎng)，于0，1，3，6，9，12，15 d取樣測(cè)定分解過(guò)程中的減重、生物量及酶活等指標(biāo)，3次重復(fù)。

1.3 谷子秸稈的總減重及各成分減重

MC1分解過(guò)程中剩余的谷子秸稈用3%醋酸浸泡去除培養(yǎng)基中的CaCO3，用已知重量的濾紙過(guò)濾，于60 ℃烘干至恒重后稱重，計(jì)算秸稈總減重。烘干后的秸稈粉碎過(guò)1 mm篩，稱取0.5 g裝入F57專用袋中，用美國(guó)ANKOM公司生產(chǎn)的ANKOM220型纖維分析儀測(cè)定纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量。

1.4 酶活測(cè)定

MC1分解谷子秸稈過(guò)程中的羧甲基纖維素酶活及木聚糖酶活測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.5 生物量測(cè)定

通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)體系中總蛋白量反應(yīng)MC1分解谷子秸稈過(guò)程中生物量的變化。培養(yǎng)體系中總蛋白包括培養(yǎng)液蛋白及菌體蛋白兩部分。將所有培養(yǎng)液分次倒入離心管中8 000 r·min-1離心10 min，上清液為第1部分蛋白液，收集的菌體備用。向三角瓶中添加50 mL無(wú)菌水，150 r·min-1振蕩30 min洗脫附著在未分解秸稈上的菌體細(xì)胞，將獲得的菌液分次倒入離心管中8 000 r·min-1離心10 min，收集第2部分菌體蛋白，并與上一步離心的菌體混合，用超聲波細(xì)胞破碎儀(Scientz-IID)破碎兩次(20 KHz)，每次5 min，破碎后的懸浮液冷卻至室溫，8 000 r·min-1離心10 min，取上清作為第2部分菌體細(xì)胞的蛋白液。蛋白濃度的測(cè)定使用BCA法[14]。

1.6 培養(yǎng)液中有機(jī)酸的測(cè)定

利用高效液相色譜儀(LC-20 A，島津)測(cè)定谷子秸稈分解過(guò)程中有機(jī)酸的累積情況。培養(yǎng)液經(jīng)12 000 r·min-1離心10 min，上清液與乙腈按體積比1∶1混合后靜置5 min，12 000 r·min-1離心10 min后上清過(guò)0.22 μm濾膜。儀器配置及條件為：伯樂(lè)Aminex HPX-87H液相色譜柱，柱溫為40 ℃，SPD-S20 A檢測(cè)器，流動(dòng)相5 mm H2SO4，流速為0.6 mL·min-1，測(cè)定時(shí)間40 min。

1.7 培養(yǎng)液中還原糖的測(cè)定

采用蒽酮硫酸法測(cè)定培養(yǎng)液中還原糖的濃度，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC1對(duì)谷子秸稈的分解能力

由圖1可知，MC1能夠有效分解谷子秸稈。培養(yǎng)15 d后，堿處理秸稈的總減重為61.8%，未處理秸稈的總減重為60.0%，分解6 d后兩種處理秸稈的分解率差異較小，堿處理秸稈的分解率比未處理秸稈的分解率高0.3%～3.6%。但是，3 d內(nèi)堿處理秸稈的分解速率顯著高于未處理秸稈。3 d后，對(duì)堿處理秸稈的分解率達(dá)到44.1%，而對(duì)未處理秸稈的分解率只有20.8%?？梢?jiàn)，堿處理能夠在較短時(shí)間提高M(jìn)C1對(duì)谷子秸稈的分解率，若分解時(shí)間超過(guò)6 d，MC1對(duì)未處理谷子秸稈同樣具有良好的分解效果。

圖1 谷子秸稈分解效果Fig.1 Degradation of Millet straw by MC1

2.2 木質(zhì)纖維素各成分減重

由表1可知，0 d未處理秸稈的纖維素半纖維素的總量為82.5%，堿處理秸稈為81.7%，堿處理后纖維素比例增加，半纖維素及木質(zhì)素含量減少。分解15 d后，谷子秸稈殘留的木質(zhì)纖維素成分見(jiàn)圖2，未處理秸稈殘余的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量分別為0.45 g，0.18 g，0.11 g，分解率分別為58.2%，69.3%，47.2%。堿處理秸稈殘余的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量分別為0.41 g，0.12 g，0.12 g，分解率分別為65.0%，74.3%，30.2%。可見(jiàn)，MC1對(duì)未處理谷子秸稈具有明顯的分解能力，并且對(duì)半纖維素的分解能力最強(qiáng)。

圖2 谷子秸稈分解過(guò)程中的成分減重Fig.2 Degradation of lignocellulosic components of Millet straw

2.3 分解過(guò)程中的酶活變化

圖3分析了MC1分解谷子秸稈過(guò)程水解液中羧甲基纖維素酶活及木聚糖酶活，結(jié)果顯示發(fā)酵液中的木聚糖酶活高于羧甲基纖維素酶活。堿處理秸稈為底物時(shí)，分解第9 d木聚糖酶活、羧甲基纖維素酶活均達(dá)到最高，分別為84.8 IU·mL-1和14.1 IU·mL-1。未處理秸稈為底物時(shí)，分解第9 d羧甲基纖維素酶活達(dá)到最高，為13.1 IU·mL-1，木聚糖酶活呈逐漸增加的趨勢(shì)，在第15 d達(dá)到最高為79.2 IU·mL-1。另外，從圖 3可以看出羧甲基纖維素酶活和半纖維素酶活在3 d后都有一個(gè)快速增加的趨勢(shì)，6 d后變化的幅度減少，該變化規(guī)律與秸稈分解率一致。

圖3 谷子秸稈分解過(guò)程中的酶活Fig.3 Enzyme activities during Millet straw degradation

2.4 培養(yǎng)液中還原糖的累積

由圖4可知，分解第0 d，未處理及堿處理秸稈為底物時(shí)培養(yǎng)液中的還原糖濃度分別為147.3 mg·L-1和111.4 mg·L-1，堿處理浸泡和沖洗過(guò)程會(huì)造成秸稈中還原糖的部分損失。MC1分解未處理秸稈第9 d培養(yǎng)液中的還原糖濃度達(dá)到最高為355.6 mg·L-1，分解堿處理秸稈第9 d達(dá)到一個(gè)高峰后先下降又上升，其中第9 d時(shí)培養(yǎng)液中還原糖的濃度為299.5 mg·L-1，第15天時(shí)為305.9 mg·L-1。

圖4 谷子秸稈過(guò)程中產(chǎn)生的還原糖Fig.4 Analysis of reducing sugar during Millet straw degradation

2.5 培養(yǎng)液中揮發(fā)性產(chǎn)物的變化

利用HPLC分析了MC1分解谷子秸稈過(guò)程中產(chǎn)生的主要有機(jī)酸：甲酸、乙酸和丙酸的含量，分解液中未檢測(cè)到丁酸(圖5)。結(jié)果表明乙酸產(chǎn)量高于甲酸和丙酸，分解第3 d乙酸濃度達(dá)到最高，未處理秸稈和堿處理秸稈為底物時(shí)的濃度分別為1.18 g·L-1、1.27 g·L-1。分解過(guò)程中甲酸的累積規(guī)律與乙酸相似，分解第3 d，甲酸的濃度達(dá)到最高，未處理秸稈和堿處理秸稈為底物時(shí)的濃度分別為0.54 g·L-1、0.65 g·L-1。丙酸濃度在整個(gè)分解期間比較穩(wěn)定，為0.60±0.10 g·L-1。

圖5 谷子秸稈分解過(guò)程中揮發(fā)性產(chǎn)物的變化Fig.5 Changes of major volatile products during Millet straw degradation

2.6 生物量

MC1分解谷子秸稈過(guò)程中，無(wú)論是培養(yǎng)液中的蛋白還是菌體蛋白都呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖 6)。培養(yǎng)0 d，未處理秸稈和堿處理秸稈培養(yǎng)液中的蛋白濃度為437.5 mg·L-1，主要來(lái)自培養(yǎng)基中的蛋白胨成分。在整個(gè)分解過(guò)程中，培養(yǎng)液中的蛋白濃度最高出現(xiàn)在第9天，分解未處理秸稈及堿處理秸稈的濃度分別為1 810.0 mg·L-1和1 220.6 mg·L-1。菌體蛋白最高濃度出現(xiàn)在第6 d，分解未處理秸稈及堿處理秸稈的濃度分別為855.21 mg·L-1和1 405.6 mg·L-1。結(jié)果表明添加未處理秸稈有利于培養(yǎng)液中蛋白的累積，而堿處理秸稈有利于菌體蛋白的積累，并且以未處理秸稈為底物時(shí)總生物量略高于堿處理秸稈為底物。

圖6 谷子秸稈分解過(guò)程中生物量的變化Fig.6 Changes of protein concentration during Millet straw degradation

3 討論與結(jié)論

為了提高秸稈的分解效率，通常需要對(duì)秸稈進(jìn)行物理、化學(xué)或生物預(yù)處理。王慧等[16]利用復(fù)合菌系XDC-2對(duì)未經(jīng)化學(xué)處理的水稻秸稈進(jìn)行分解，12 d總質(zhì)量減少了39.71%，顯著低于堿處理水稻秸稈58.2%的降解率[17]。楊巧麗等[18]從糞便中篩選到一組木質(zhì)纖維素分解菌群，6 d對(duì)未經(jīng)化學(xué)處理但粉碎后的小麥秸稈、稻草秸稈、玉米秸稈的降解率分別為47.0%，48.62%及50.21%。復(fù)合菌系MC1能夠15 d分解堿處理秸稈的61.8%，未處理秸稈的60.0%，6 d對(duì)2種秸稈的分解率都達(dá)到50%以上。另外，焦有宙等利用幾株木質(zhì)纖維素優(yōu)勢(shì)土著菌及其混合菌對(duì)玉米秸稈進(jìn)行分解，35 d對(duì)纖維素、半纖維素的最高分解率為46.32%和48.53%[19]，而MC1能夠在14 d分解玉米秸稈纖維素的53.1%，半纖維素的76.4%[20]。主要由于復(fù)合菌系沒(méi)有破壞菌群之間的協(xié)同共生關(guān)系，對(duì)天然木質(zhì)纖維素的分解能力大于單個(gè)菌株或菌株的簡(jiǎn)單混合。

谷子秸稈分解過(guò)程中可產(chǎn)生還原糖、甲酸、乙酸及丙酸等能源物質(zhì)，甲酸和乙酸濃度在分解的第3 d達(dá)到最高。有研究表明秸稈水解酸化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生短鏈揮發(fā)性產(chǎn)物，同時(shí)對(duì)木質(zhì)纖維素材料的進(jìn)一步水解酸化有重要意義，另外有機(jī)酸的種類、濃度的變化取決于pH、微生物的種類、溫度及有機(jī)物的種類等[21～22]。秸稈水解后的有機(jī)酸尤其是乙酸、丁酸被認(rèn)為是產(chǎn)甲烷的最適底物，能夠促進(jìn)甲烷效率并提高甲烷生產(chǎn)的穩(wěn)定性[23]。

MC1分解谷子秸稈過(guò)程中以未處理秸稈為底物時(shí)總生物量略高于堿處理秸稈為底物。李湘等利用復(fù)合菌系MC1降解不同預(yù)處理后的玉米秸稈也發(fā)現(xiàn)，未處理秸稈的生物量要大于堿處理秸稈，并且氣爆處理后生物量最大[24]。綜上，高效木質(zhì)纖維素分解復(fù)合菌系MC1能有效分解未經(jīng)任何處理的谷子秸稈，可產(chǎn)生還原糖、有機(jī)酸等能源物質(zhì)，為谷子秸稈的資源利用提供依據(jù)。