陳 偉, 柏正武

(武漢工程大學(xué) 環(huán)境與化工清潔生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 湖北 武漢 430073)

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力、創(chuàng)新思維的重要環(huán)節(jié)。綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革與創(chuàng)新是實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究的熱點(diǎn),也是構(gòu)建和完善多層次實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系有效途徑[1]。將科研成果轉(zhuǎn)化為綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容,能激發(fā)大學(xué)生科研興趣,提升科學(xué)研究和科技創(chuàng)新能力,促進(jìn)教學(xué)科研融合,更有利于形成科研支持教學(xué)、教學(xué)科研協(xié)同發(fā)展的良好局面[2]。

甲殼素是自然界中含量豐富的氨基多糖,殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物。殼聚糖因具有無毒、生物可降解和生物相容性等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于水處理、藥物載體、化妝品、食品以及制藥等領(lǐng)域[3]。殼聚糖脫乙酰度(degree of deacetylation, D.D.)的高低和分子量的大小直接影響到殼聚糖及其衍生物的吸附特性[4-5]、抑菌性能[6]以及分離性能[7-8]。因此,不同分子量的超高脫乙酰度殼聚糖的制備具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本課題組近年結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,通過多次實(shí)驗(yàn),總結(jié)出一套成熟的制備超高脫乙酰度殼聚糖的方法,并合成了100多種手性識別能力強(qiáng)、穩(wěn)定好的殼聚糖衍生物手性固定相[9]。本文基于課題組有關(guān)殼聚糖的研究成果,設(shè)計(jì)了超高脫乙酰度殼聚糖的制備與表征綜合實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)從天然甲殼素的預(yù)處理出發(fā),包含殼聚糖降解與脫乙酰反應(yīng)、核磁共振分析、紅外光譜分析、高分子分子量的測定等內(nèi)容,將殼聚糖制備、結(jié)構(gòu)分析、分子量的測定和大型儀器的應(yīng)用結(jié)合在一起。

1 實(shí)驗(yàn)原理

甲殼素通過降解得到超高脫乙酰度殼聚糖(脫乙酰度大于95%),其降解的方法主要有化學(xué)降解、物理降解和酶降解等,化學(xué)降解又包括H2O2氧化法、酸性或堿性水解法等[10]。將甲殼素在含NaBH4的NaOH/H2O體系中回流反應(yīng),干燥后再在正戊醇/NaOH體系中回流反應(yīng),就能制備出超高脫乙酰度的殼聚糖(見圖1)。通過調(diào)整反應(yīng)時(shí)間和溫度可以得到不同分子量殼聚糖。如果部分殼聚糖因氧化而呈黃色,可用NaBH4還原,使之變成白色。用該方法制備的殼聚糖脫乙酰度可以達(dá)到98%以上,該方法實(shí)用、可靠,簡單易行。

圖1 殼聚糖的制備途徑

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

試劑：蝦殼(工業(yè)級),購自濰坊市海納甲殼素廠；氫氧化鈉、硼氫化鈉、戊醇、冰醋酸、氯化鈉和溴化鉀均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氘代三氟乙酸,美國劍橋CIL(同位素標(biāo)準(zhǔn)品)公司。

儀器：烏氏黏度計(jì)(毛細(xì)管直徑0.5～0.6 mm)；低溫恒溫反應(yīng)浴,鞏義市英峪予華儀器廠；JYL-C012九陽料理機(jī),九陽股份有限公司；金屬絲編織網(wǎng)試驗(yàn)篩(φ200 mm×50 mm, 0.15 mm/0.1 mm),中國航空工業(yè)第五四零廠；FT-IR紅外光譜儀,美國PerkinElmer公司；Agilent DD2 400 MHz核磁共振儀,美國安捷倫公司；Vario EL Ⅲ CHNOS型元素分析儀,德國Elementar公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程見圖2。

圖2 超高脫乙酰度殼聚糖的制備與表征流程

2.3 殼聚糖的制備

用蒸餾水將片狀蝦殼洗凈并干燥,粉碎、過篩,收集篩網(wǎng)下的蝦殼粉甲殼素作為原料。參考文獻(xiàn)[11]方法,稱取20.00 g干燥的甲殼素于500 mL的三口瓶中,按照甲殼素、NaBH4、NaOH、水質(zhì)量比為10∶1∶81.82∶100分別加入163.64 g NaOH、2.00 g NaBH4、200.00 g蒸餾水中,升溫至140 ℃,回流反應(yīng)4 h；將反應(yīng)液倒入裝有蒸餾水的燒杯中攪拌后趁熱過濾,洗至中性,干燥；產(chǎn)品再按相同的比例重復(fù)反應(yīng)4 h,得到超高脫乙酰的殼聚糖；然后,將以上制備的殼聚糖按照殼聚糖、NaBH4、NaOH、正戊醇質(zhì)量比為10∶1.1∶50∶110加入到500 mL的三口瓶中，在150 ℃回流6 h,將反應(yīng)液倒入裝有蒸餾水的燒杯中攪拌后趁熱過濾,用水洗至中性,烘干得13.8 g 白色有珍珠光澤的片狀固體,產(chǎn)率為69%。

2.4 殼聚糖脫乙酰度的測定

將15 mg殼聚糖完全溶解0.5 mL CF3COOD中,經(jīng)核磁共振儀掃描得到譜圖。根據(jù)譜圖中不同化學(xué)環(huán)境的氫質(zhì)子的積分面積,計(jì)算殼聚糖的脫乙酰度DD[12]。計(jì)算公式如下：

(1)

其中HAC表示甲殼素乙?；系募谆鶜涞姆迕娣e,H1-6表示殼聚糖結(jié)構(gòu)單元骨架上氫的峰面積。

2.5 殼聚糖黏均分子量的測定

將0.25 g殼聚糖溶解于0.1 mol/L CH3COOH與0.2 mol/L NaCl溶劑中,并用100 mL容量瓶定容,得到質(zhì)量濃度為2.5 g/L的殼聚糖溶液；再用稀釋法分別配制質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、1.5 g/L的殼聚糖溶液。經(jīng)砂芯漏斗過濾,用移液管移取10 mL濾液于烏式黏度計(jì)中,在25 ℃的水浴中恒溫10 min以上[13]；用秒表分別測定5種殼聚糖溶液和溶劑在黏度計(jì)中的下落時(shí)間。根據(jù)Mark-Houwink方程計(jì)算殼聚糖的黏均分子量。

相對黏度ηr=t/t0(溶液流出時(shí)間/純?nèi)軇┑牧鞒鰰r(shí)間),增比黏度ηsp=ηr-1。在無限稀釋條件下,比濃黏度ηsp/c與lnηr/c的極限值都等于特性黏度[η],其中[η]=KMα,K=1.81×10-3,α=0.93[14]。

2.6 殼聚糖的紅外光譜和元素分析

采用KBr壓片法將樣品制成薄片,用紅外光譜儀掃描降解前后的殼聚糖,分辨率設(shè)為4 cm-1,掃描次數(shù)為16,分析降解殼聚糖的結(jié)構(gòu)變化。甲殼素和殼聚糖中C、H和N用Elementar元素分析儀在CHN模式下測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 殼聚糖脫乙酰度的測定

殼聚糖的脫乙酰度是指脫除乙?；奶菤埢鶖?shù)占?xì)ぞ厶欠肿又械奶菤埢鶖?shù)的百分?jǐn)?shù)。殼聚糖脫乙酰度的測定方法主要有滴定法、核磁共振波譜法和色譜法等方法[15]。其中滴定法因裝置簡單、操作簡便,常用于脫乙酰度的測定[16],但滴定法存在著樣品用量較大、滴定操作不易控制、終點(diǎn)不易觀察等缺點(diǎn)。核磁共振波譜法(NMR)準(zhǔn)確度高且重現(xiàn)性好,是美國材料與試驗(yàn)協(xié)會認(rèn)定的測定殼聚糖脫乙酰度標(biāo)準(zhǔn)方法[17],也是測定殼聚糖脫乙酰度最準(zhǔn)確的方法之一。殼聚糖乙?；系募谆鶜浜徒Y(jié)構(gòu)單元骨架上氫的化學(xué)位移值不同,通過測試這兩部分氫質(zhì)子的積分面積就可以計(jì)算出殼聚糖的脫乙酰度。

圖3為所制備的殼聚糖的1H NMR譜圖(圖上方數(shù)字為積分面積),δ=2.3×10-6處為殼聚糖中殘留的乙?；系募谆鶜?δ=(3.73～5.43)×10-6處為殼聚糖結(jié)構(gòu)單元骨架上的氫,將其積分面積分別代入公式(1),計(jì)算出殼聚糖脫乙酰度為99.3%。

圖3 殼聚糖的1H NMR譜圖(TFA-D, 298 K, 400 MHz)

3.2 殼聚糖黏均分子量的測定

分子量的高低對殼聚糖性質(zhì)和應(yīng)用有較大影響[6],用光散射法和凝膠色譜法分別可以測定殼聚糖的重均分子量和數(shù)均分子量。因本實(shí)驗(yàn)只需得到相對的分子量，且這兩種方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)備較昂貴,故選擇黏度法測定分子量。殼聚糖的特性黏度直接反映了殼聚糖的分子量大小,黏度就越大,其相對分子量越高。

根據(jù)殼聚糖溶液流出時(shí)間和純?nèi)軇┑牧鞒鰰r(shí)間,計(jì)算相對黏度ηr和增比黏度ηsp,以比濃黏度ηsp/c對濃度c作圖,得一條曲線,以lnηr/c對c作圖得另一條曲線。將兩條曲線擬合后外推至濃度c→0,得到特性黏度[η],如圖4所示。由公式[η]=KMα(其中K=1.81×10-3,α=0.93)計(jì)算得殼聚糖黏均分子量為14.6萬。

圖4 特性黏度曲線

3.3 殼聚糖的紅外表征和元素分析

圖5為甲殼素與不同脫乙酰度的殼聚糖的傅里葉紅外(FTIR)譜圖。從圖5中a可以看出,在1 655 cm-1以及1 622 cm-1處有非常明顯吸收峰，為甲殼素的酰胺I帶特征吸收峰,該雙重峰分別是CO與相鄰的分子鏈上N—H或O—H之間形成兩種不同氫鍵形成的[18]；在1 560 cm-1左右吸收峰為酰胺Ⅱ帶特征吸收峰,N—H彎曲變形吸收峰；在1 315 cm-1左右吸收峰為酰胺III帶特征吸收峰,—C—N伸縮振動(dòng)吸收峰。隨著脫乙酰度的增加,酰胺I和III帶的吸收峰逐漸消失,酰胺II帶的吸收峰隨著DD的提高從1 560 cm-1移向高波數(shù)至1 597 cm-1 [19]。當(dāng)脫乙酰度為97.93%時(shí)的殼聚糖在1 654 cm-1處的峰強(qiáng)度明顯減弱,1 595 cm-1處的N—H變得更加尖銳：當(dāng)DD為99.88%的殼聚糖的羰基吸收峰已經(jīng)消失,只有1 597 cm-1處的N—H峰,視為完全脫乙酰。

圖5 甲殼素及殼聚糖的紅外光譜圖

FT-IR譜圖既能反映高分子官能團(tuán)結(jié)構(gòu)特征,又能反映高分子的結(jié)晶性。殼聚糖結(jié)晶度的增加會使C—H伸縮振動(dòng)峰向低頻移動(dòng)[18]。因此可以通過2 960～2 840 cm-1處的C—H伸縮振動(dòng)吸收帶的變化來判斷殼聚糖結(jié)晶狀態(tài)的變化。從圖5可知,甲殼素的C—H伸縮振動(dòng)峰為2 891 cm-1,而脫乙酰度97.93%和99.88%殼聚糖的C—H伸縮振動(dòng)峰分別為2 884 cm-1和2 883 cm-1,C—H伸縮振動(dòng)峰向低波數(shù)移動(dòng),表明制備的殼聚糖的結(jié)晶度有所升高。結(jié)晶度的提高雖然不利于殼聚糖進(jìn)一步修飾反應(yīng),但高分子結(jié)構(gòu)更加規(guī)整,有利于殼聚糖衍生物的分離性能和溶劑耐受性[9]。另外,甲殼素的1 075 cm-1處的振動(dòng)吸收峰隨著脫乙酰度增加,逐漸變寬,表明殼聚糖分子的β-糖苷鍵發(fā)生了部分?jǐn)嗔?殼聚糖分子量降低。

(C6H11NO4·0.25H2O)n元素分析結(jié)果:理論值,C含量為43.50%、H含量為7.00%、 N含量為8.46%; 實(shí)測值C含量為43.21, H含量為7.09, N含量為7.87,實(shí)測值和理論計(jì)算值誤差較小。依據(jù)C、H、N等元素的組成來推斷結(jié)構(gòu)式,對樣品的純度要求很高,而殼聚糖在干燥時(shí)難以完全除去結(jié)晶水,在稱量過程中也容易吸附水,因此在計(jì)算結(jié)果時(shí),采用了校正的方法,將理論值增加了0.25%的H2O。

4 結(jié)語

本文所介紹的殼聚糖的制備與表征是將科研成果中較為成熟且難度適中的內(nèi)容轉(zhuǎn)化成學(xué)生可以實(shí)際操作的本科綜合性實(shí)驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)包含天然蝦殼的處理、粉碎、過篩、降解、脫乙酰等制備過程及紅外光譜、核磁共振光譜、元素分析和分子量的測定等表征過程。本綜合實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件簡單、結(jié)果可靠,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)和高分子化學(xué)等學(xué)科的知識點(diǎn),將科研與教學(xué)有機(jī)結(jié)合,強(qiáng)化了基礎(chǔ),拓寬了學(xué)生的知識面。

在組織本科生課外科研活動(dòng)的過程中,圍繞超高脫乙酰度的殼聚糖制備和表征,開展了一系列殼聚糖應(yīng)用研究。申報(bào)并完成了與之相關(guān)的3項(xiàng)武漢工程大學(xué)生校長基金項(xiàng)目,完成了兩屆本科畢業(yè)論文。近3年,在該綜合實(shí)驗(yàn)的實(shí)施和支撐下,應(yīng)用化學(xué)專業(yè)的兩位學(xué)生獲得湖北省優(yōu)秀學(xué)士學(xué)位論文,3位學(xué)生分別獲湖北省第8～10屆大學(xué)生化學(xué)(化工)學(xué)術(shù)創(chuàng)新成果報(bào)告會二等獎(jiǎng)。