趙永霞，謝 健，李 升，周禮紅

（1.茅臺學(xué)院釀酒工程系，貴州仁懷564500；2.遵義醫(yī)學(xué)院遺傳教研室，貴州遵義563000；3.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州貴陽550025；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

藍(lán)光是自然界中非常重要的環(huán)境因素之一。對于真菌而言，藍(lán)光主要是信息的載體，對它們的生長代謝起著重要的調(diào)控作用，真菌通過藍(lán)光受體[1]（一種含有核黃素的轉(zhuǎn)錄因子）來接收光刺激，不論藍(lán)光帶給它們的是有益的還是有害的影響，從進(jìn)化角度都會增強其對環(huán)境的適應(yīng)性。光調(diào)控在Neurospora crassa、Aspergillus nidulans、Aspergillus flavus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus parasiticus、Penicillium sp.和Fusarium sp.都有研究，甚至海洋來源的絲狀真菌[2]也有報道，藍(lán)光可以激發(fā)Neurospora crassa無性生活循環(huán)，影響菌絲體類胡蘿卜素的合成[3]、無性孢子的形成以及晝夜節(jié)律的方向[4]，還影響有性生活循環(huán)和原子囊殼的形成，以及其趨光性等不同的生理反應(yīng)[5]。紅曲霉是中國傳統(tǒng)藥食兼用菌種，可代謝產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，廣泛用于釀酒、制藥等領(lǐng)域，其生理反應(yīng)、生長發(fā)育、代謝等也會受到藍(lán)光的調(diào)控。研究報道發(fā)現(xiàn)，光照會影響Monascus anka菌絲的生長和孢子的形成，以及次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[6]；抑制Monascus ruberN氣生菌絲的形成，影響其菌落的形態(tài)[7]；降低桔霉素的產(chǎn)量，抑制菌絲體過氧化氫酶的活性[8]。Tsuyoshi Miyake等人對Monascus pilosus進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同波長的光照對菌絲的長短、疏密、無性孢子的形成量及有性孢子的萌發(fā)都有一定的影響[9]。藍(lán)光作為光信號可以激發(fā)上調(diào)類胡蘿卜素合成途徑[10-11]，增加carRA and carB基因的轉(zhuǎn)錄[12]。藍(lán)光可以通過或者部分通過cAMP途徑調(diào)節(jié)M.aurantiacus桔霉素代謝以及孢子生產(chǎn)[13]。

微生物向外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)是其生存所必需的，外界的銨鹽濃度對真菌的生長至關(guān)重要，NH3可以通過自由擴(kuò)散也可通過主動運輸進(jìn)入細(xì)胞[14]。銨鹽培養(yǎng)基存在生長平衡，對銨鹽的吸收可轉(zhuǎn)化為生物量[14]和次級代謝產(chǎn)物，而硝酸鹽對真菌的生長有初始抑制作用，所以沒有生長平衡，而是作為儲存能量，為真菌的發(fā)育提供能量[15]。光調(diào)控與氮源調(diào)控存在相關(guān)性[16]，在液體培養(yǎng)基中，氮源缺乏也會激發(fā)真菌的分生孢子的形成，而且受到藍(lán)光的調(diào)控[17]。大量研究表明，藍(lán)光和氮源對紅曲霉的調(diào)控起著重要的作用，因此本課題組采用藍(lán)光和黑暗，結(jié)合以不同氮源對Monascus anka的生長發(fā)育及色素合成進(jìn)行研究，以期初步揭示藍(lán)光、氮源對紅曲霉生長發(fā)育及色素合成的調(diào)控模式。

1 材料與方法

1.1 材料

GZU4577菌株：Monascus anka，保藏于貴州大學(xué)真菌資源研究所。

沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH值自然，121℃滅菌25 min。用于菌種的活化和斜面培養(yǎng)。

無氮源Czapek培養(yǎng)基：K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH值自然。

1.2 實驗方法

向無氮源察氏培養(yǎng)基分別添加1%（W/L）的NH4NO3、1%NH4Cl、1%NaNO3作為氮源，氮饑餓作為對照，后續(xù)同上。

將以上不同種類調(diào)控培養(yǎng)基分別置于藍(lán)光（470～480 nm），黑暗條件下，28℃連續(xù)培養(yǎng)9 d。燈管長115 cm，28 W，使用2個光源。

光照強度=(光源總光通量×CU×MF)/面積。

光通量：1160 lm；CU：利用系數(shù)；室內(nèi)一般取0.4；MF：維護(hù)系數(shù)0.8。

培養(yǎng)箱長150 cm，寬110 cm，面積=150×110=16500 cm2=1.65 m2。光照強度

1.2.1 形態(tài)觀察方法

每天觀察菌落形態(tài)及其變化，每隔24 h數(shù)碼照相機(jī)拍照，測量直徑，光學(xué)顯微鏡觀察菌絲，孢子變化及邊緣菌絲的變化。培養(yǎng)7 d后，從菌落邊緣采集菌絲3處，制片，顯微鏡下觀察。

1.2.2 色素提取及測定方法

將培養(yǎng)好的紅曲霉菌落置于烘箱里烘干，測定干重，研碎，置于帶塞試管中，加入10 mL 80%乙醇避光浸提5 h，獲得色素粗提物。稀釋一定倍數(shù)后，置于酶標(biāo)儀中，分別在510 nm、465 nm、410 nm測定其吸收度，以及進(jìn)行全波長掃描。其中以505 nm的吸收值代表紅色素，465 nm的吸收值代表橙色素，410 nm的吸收值代表黃色素。色價（U/g）計算方法：色價U/g=(OD×稀釋倍數(shù))/菌體干重。

1.2.3 孢子數(shù)計數(shù)方法

將培養(yǎng)9 d的平皿，用內(nèi)徑（d）10.00 mm的打孔器在菌落上均勻打孔，置于有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，加入若干0.2%TWeen 80溶液，漩渦振蕩洗孢子，4層擦鏡紙過濾，血球計數(shù)板(采用25個中方格計數(shù)板)顯微鏡計數(shù)分生孢子（平均4重復(fù)），未過濾，顯微鏡計數(shù)閉囊殼（平均4重復(fù)）。

孢子數(shù)計算：5個中方格的總孢子為A，孢子液稀釋倍數(shù)為B，內(nèi)徑為d，則：

1.2.4 統(tǒng)計分析方法

采用OFFICE EXCEL 2007進(jìn)行計算，分析軟件SPSS Statistics17.0對所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)光結(jié)合不同氮源對菌落生長的影響

圖1是藍(lán)光結(jié)合不同氮源對GZU4577的菌落形態(tài)和生長的影響，表1進(jìn)行了菌落形態(tài)的描述，從圖1可以看出，藍(lán)光顯著抑制了菌株的徑向生長。藍(lán)光的刺激抑制GZU4577氣生菌絲的形成，產(chǎn)生的氣生菌絲較稀疏，菌落呈不規(guī)則狀，菌株顏色沒有發(fā)生變化。以NaNO3為氮源，藍(lán)光顯著抑制了菌株的生長，延遲了菌株變色時間（表1），推測NaNO3會抑制色素的合成。以NH4Cl或NH4NO3為氮源時，藍(lán)光同樣顯著抑制菌株的生長，但是氣生菌絲為白色，基質(zhì)菌絲為紅色，菌株變色較快，氣生菌絲生長相對旺盛（圖1，表1）。當(dāng)以銨態(tài)氮為氮源的條件下，藍(lán)光的抑制效應(yīng)減弱。黑暗條件下的氣生菌絲相對稠密，菌落呈現(xiàn)規(guī)則圓形，氣生菌絲隆起也較高，為白色，有利于黃色素的合成，生長后期的菌落邊緣出現(xiàn)不規(guī)則扇形（圖1，表1）。

圖1 Czapek培養(yǎng)基，添加不同氮源，考察藍(lán)光對GZU4577形態(tài)的影響

表1 Czapek培養(yǎng)基藍(lán)光對GZU4577菌落表面特征的影響

2.2 藍(lán)光結(jié)合不同氮源對分生孢子和閉囊殼的影響

不論是藍(lán)光條件或是黑暗條件，是否補充氮源，都能夠形成分生孢子，GZUMA-4氮饑餓條件下，藍(lán)光有利于分生孢子的形成，但是添加氮源后，藍(lán)光反而抑制了分生孢子的產(chǎn)生。添加3種外源氮源后的分生孢子量之間沒有顯著差異，均少于氮饑餓條件。而黑暗條件下，氮饑餓則對分生孢子的產(chǎn)生無促進(jìn)作用，添加氮源后都促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生，NH4NO3為氮源時分生孢子量最大(圖2)。以NaNO3、NH4Cl或 NH4NO3為氮源，藍(lán)光抑制閉囊殼的形成，氮饑餓藍(lán)光或黑暗條件下形成的閉囊殼數(shù)量非常的少，以致有些用顯微觀察仍未觀察到，說明閉囊殼的形成，氮源是必需的營養(yǎng)物。黑暗條件在一定量的氮源存在的情況下有利于閉囊殼的形成，有利于GZUMA-4從營養(yǎng)生長進(jìn)入到有性生殖期，且銨態(tài)氮相對于硝態(tài)氮更有利于閉囊殼的形成（圖2）。

2.3 藍(lán)光和不同氮源對色素產(chǎn)生的影響

從圖3可以看出，藍(lán)光調(diào)控紅曲色素的合成。氮饑餓或添加氮源藍(lán)光均抑制3種色素的合成。藍(lán)光條件下，NaNO3與對照組無顯著性差異，NH4Cl和NH4NO3均促進(jìn)色素的合成。黑暗條件下，氮源均促進(jìn)了色素的積累，黃色素合成最優(yōu)。氮源缺乏嚴(yán)重阻礙了GZU4577紅曲色素的合成。銨態(tài)氮源有利于色素的合成，硝態(tài)氮抑制色素的合成。不論氮饑餓或補充一定量的氮源，藍(lán)光都抑制色素的合成。

圖2 Czapek培養(yǎng)基不同氮源，藍(lán)光對GZU4577孢子量的影響（9 d）

圖3 Czapek培養(yǎng)基不同氮源，藍(lán)光對GZU4577色價的影響

3 討論

GZU4577生長在氮源貧乏的Czapek培養(yǎng)基中時，生長速率緩慢以及色素的積累都較少，外源無機(jī)氮源的作用很大，幾乎直接刺激菌株的生長發(fā)育和色素的產(chǎn)生。藍(lán)光對GZU4577的生長發(fā)育以及色素合成皆有負(fù)調(diào)控，同時與培養(yǎng)基中的氮源對菌株的生長發(fā)育及色素的合成有交叉調(diào)控。

藍(lán)光可以通過多種途徑影響真菌代謝及生長。Neurospora crassa、Aspergillus niger的菌絲形態(tài)，孢子生殖等受到藍(lán)光的調(diào)控[18-19]。一些藍(lán)光調(diào)控基因也受到氮饑餓的調(diào)控[17]，中間還有些基因受到晝夜節(jié)律的調(diào)控，一部分還包含在氮源代謝途徑中[20]。所以說光反應(yīng)和氮源代謝存在一定關(guān)系。以Czapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在28℃下連續(xù)培養(yǎng)9 d后發(fā)現(xiàn)氮饑餓或者一定量的氮源存在，藍(lán)光將會抑制菌株的徑向生長和氣生菌絲的形成，可能存在某種抑制機(jī)制。此外，硝酸鹽也抑制菌株的徑向生長，存在硝酸鹽抑制效應(yīng)，而且在藍(lán)光條件下，抑制增強，這說明硝酸鹽和藍(lán)光之間有協(xié)同抑制效應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)，銨鹽對菌株的徑向生長有利，銨態(tài)氮尤其是NH4NO3氮源有利于GZU4577氣生菌絲的形成。

光信號的感知和傳遞是一個及其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響真菌的生殖、生物鐘的重置以及對孢子釋放等，有文獻(xiàn)報道Phycomyces blakesleeanus在光照和重力的影響下，孢囊柄會長到幾個厘米的長度[21]。早期研究表明，Aspergillus nidulans產(chǎn)生無性孢子，光是不可或缺的因素[22]。但是我們在黑暗條件和不同光照條件下連續(xù)培養(yǎng)到第9天進(jìn)行孢子計數(shù)，結(jié)果證實紅曲霉都可以形成分生孢子，與Aspergillus nidulans光調(diào)控機(jī)制有所不同。氮饑餓條件下藍(lán)光有利于分生孢子的形成，與文獻(xiàn)報道[17]中，藍(lán)光誘導(dǎo)Phycomyces blakesleeanus大型分生孢子囊形成的結(jié)果一致。藍(lán)光有利于GZU4577從營養(yǎng)生長進(jìn)入到無性生殖，但是補充氮源后調(diào)控規(guī)律會發(fā)生變化，說明光調(diào)控會受到菌株的營養(yǎng)成分的影響。黑暗條件在一定量的氮源存在的情況下，有利于閉囊殼的形成，有利于GZU4577從營養(yǎng)生長進(jìn)入到有性生殖期，且銨態(tài)氮相對于硝態(tài)氮更有利于閉囊殼的形成。黑暗也有助于GZU4577從營養(yǎng)生長進(jìn)入有性生殖期，這與許多絲狀真菌類似，如：黑暗促進(jìn)一種海洋來源的Aspergillus glaucus的有性發(fā)育[2]，銨態(tài)氮也有助于從營養(yǎng)生長進(jìn)入有性生殖，硝酸鹽阻礙有性發(fā)育的轉(zhuǎn)化，與Mariette Carels[23]研究結(jié)果有所不同，不同菌種接受光調(diào)控模式可能有所不同。

光照條件對生物體許多代謝都有調(diào)控作用，包括類胡蘿卜素代謝、糖代謝、幾丁質(zhì)代謝，脂肪酸代謝及氨基酸代謝等，對許多聚酮體類代謝產(chǎn)物也有調(diào)控作用[24]。以Czapek基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)GZU4577菌株，無論氮源如何，藍(lán)光均抑制色素的合成，以NH4Cl或NH4NO3為氮源時，抑制效應(yīng)減弱。氮源缺乏會嚴(yán)重阻礙GZU4577紅曲色素的合成，NaNO3氮源充足也不利于紅曲色素的合成，結(jié)果與文獻(xiàn)[23，25]報道的一致。不同的藍(lán)光強度會影響色素的合成，采用300 lux和450 lux藍(lán)光會降低色素的產(chǎn)量[25]，曾有報道完全黑暗可增加真菌色素的合成[26]，這與實驗結(jié)論一致。而且不同的光照強度和光照時間對紅曲霉色素的合成影響不同[27]，需要后續(xù)更深入的研究，為紅曲霉的光調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。