陳夢圓，李志軍，羅愛民

(1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443000)

四甲基吡嗪，又名川芎嗪，是白酒中的健康因子以及主要功能性成分之一，賦予白酒有益健康的功能[1]，因此，白酒中四甲基吡嗪的研究成為白酒健康因子方面研究的重要方向。四甲基吡嗪在不同香型白酒中普遍存在[2]。由于不同的釀造工藝，導(dǎo)致不同香型白酒中四甲基吡嗪含量差異較大[3]。其在醬香型白酒中含量較高，在其他香型白酒中偏低[4]。

高溫制曲是醬香型白酒獨特的工藝之一[5]，也是導(dǎo)致醬香型白酒中四甲基吡嗪含量比其他香型白酒高的重要原因[6]。研究顯示，制曲階段所產(chǎn)生的四甲基吡嗪是白酒中四甲基吡嗪的主要來源之一[7]，因此，高溫大曲是影響白酒中四甲基吡嗪含量的主要因素，且高溫大曲中產(chǎn)四甲基吡嗪能力較強的微生物主要是芽孢桿菌[8]。本研究從高溫大曲中篩選高產(chǎn)四甲基吡嗪的菌株，為制備高產(chǎn)四甲基吡嗪的功能曲提供一定的理論支持，為提高白酒中四甲基吡嗪含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：高溫大曲、稻殼、麩皮，均由某酒廠提供。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(L)：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，pH 7.0～7.2，121 ℃ 滅菌30 min。

液體培養(yǎng)基(L)：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌 20 min。

富集培養(yǎng)基(L)：酵母膏3 g，蛋白胨10 g，淀粉3 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO42 g，pH7.8，121 ℃滅菌20 min。

麩皮培養(yǎng)基：麩皮過40目篩，稻殼過10目篩，按麩皮∶稻殼4∶1混合，常壓下蒸30 min，使水分含量為36%。裝入錐形瓶中用8層紗布封口，121℃滅菌30 min。

試劑：四甲基吡嗪標(biāo)品（98%），北京盛世康普化工技術(shù)研究院；乙偶姻標(biāo)品（98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙醇，色譜純，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；MJ-250型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WH-2型微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；5810R臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；2720 thermal cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)儀 Applied Biosysterms，上海賽默生物科技有限公司；DYCP-31 DNA電泳槽、DYY-5穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀，上海復(fù)日科技儀器有限公司；7890A自動進樣氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；安捷倫1200高效液相色譜儀，配有紫外檢測器、C18110A(250×4.60 mm)色譜柱；SW-CJ-ID雙人單面超凈工作臺，江蘇凈化設(shè)備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株分離與純化

在無菌環(huán)境下稱取10.00 g高溫大曲粉碎樣品到100 mL無菌水中，37℃、120 r/min振蕩30 min。然后在85℃水浴鍋中水浴30 min。取水浴后的上清液5.0 mL加入到95 mL的富集培養(yǎng)基中，37℃、140 r/min振蕩富集培養(yǎng)24 h。將富集液進行梯度稀釋，依次配成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液。取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度的菌懸液各0.1mL，分別涂布平板，37℃條件下倒置培養(yǎng)24 h。獲得的單菌落經(jīng)多次平板劃線和平板涂布交替進行的步驟得以純化。將純化后的細(xì)菌制片染色，觀察菌落形態(tài)及細(xì)菌形態(tài)，去掉重復(fù)的細(xì)菌，將篩出的單菌分別保存。

1.2.2 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的篩選

1.2.2.1 種子菌懸液的制備

將分離得到的單菌落分別接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h。挑取1環(huán)菌落到液體培養(yǎng)基中，37℃，140 r/min培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后，在無菌條件下測搖勻后的液體培養(yǎng)基在600 nm條件下的OD值，用無菌水稀釋使液體培養(yǎng)基的光密度OD值為0.7，使其菌濃度相等。

1.2.2.2 發(fā)酵樣品的處理

稱取25 g樣品，加入0.25 g的無水氯化鈣和57%vol的乙醇溶液50 mL，浸泡搖勻，在25℃條件下經(jīng)超聲波浸提20 min，10000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，每個樣品做3個平行樣，將得到的上清液合并，即得到待測樣品。

1.2.2.3 四甲基吡嗪的測定

高效液相色譜條件[9]：色譜柱：Agilent TC-C18(2)(4.6 mm×250 mm,0.5 μm)；檢測器：VWD檢測器；檢測波長278 nm；流動相：水溶液(加0.05%三氟乙酸)∶甲醇=3∶7；流速1 mL/min。

四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用57%vol的乙醇溶液將四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L的濃度，以濃度為橫坐標(biāo)，峰高為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.4 揮發(fā)性產(chǎn)物測定

內(nèi)標(biāo)液：濃度17.54 mg/100 mL的乙酸正戊酯、18.15 mg/100 mL的2-乙基丁酸和15.8 mg/100 mL的叔戊醇。

色譜條件：色譜柱，ZB-Waxplux毛細(xì)柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1 min，以4℃/min升至150℃，保持10 min，再以10℃/min升至210℃，保持18 min，最后以20℃/min升至230 ℃，保持5 min；載氣(N2)流速1 mL/min，分流比20∶1。

1.2.2.5 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的初篩

將種子菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%接種到麩皮培養(yǎng)基中，混合均勻后37℃培養(yǎng)3 d（每天搖動2次麩皮培養(yǎng)基，使菌株在固體培養(yǎng)基中均勻發(fā)酵），按照1.2.2.2和1.2.2.3方法測定其中四甲基吡嗪含量。重復(fù)此步驟3次，篩出穩(wěn)定高產(chǎn)四甲基吡嗪的菌株。

1.2.2.6 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的復(fù)篩

將種子菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%接種到麩皮培養(yǎng)基中，混合均勻后培養(yǎng)8 d，1～5 d溫度為37℃，6～7 d溫度為45℃，第8天的溫度為60℃。發(fā)酵結(jié)束后，按照1.2.2.2和1.2.2.4測定其揮發(fā)性產(chǎn)物。

以上各題很容易，第一題心算即可；第二題用豎式加法；第三題長除法或者心算；最后一題心算.未知題目中所要求的幾種新方法有何優(yōu)越性？第四題本是簡單的兩位數(shù)加減；按照題目要求的方法來做，需要分別在數(shù)表中數(shù)30個小格，或者50個小格！這樣一些原始的、繁瑣笨拙的方法，居然堂而皇之地寫進了教科書；令人無語.

1.2.3 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)鑒定

菌落形態(tài)觀察：將菌株劃線轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)48 h后觀察其在培養(yǎng)基上顏色、大小、質(zhì)地、邊緣整齊性、表面光滑性等菌落形態(tài)特征。

細(xì)胞形態(tài)觀察：接種菌株到液體培養(yǎng)基中，在37℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h。將活化后的菌株制片，在40倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3.2 細(xì)菌16S rDNA鑒定

采用細(xì)菌提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。引物采用27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3[10]50 μL PCR擴增反應(yīng)體系：基因組 DNA（20 ng/μL）1.0 μL、10×Buffer(含 2.5 mM Mg2+)5.0 μ L、Taq 聚合酶(5 u/μL)1.0 μL、dNTP（10 mM）1.0 μL、27F 引物(10 uM)1.5 μL、1492R 引物 (10 uM)1.5 μL、ddH2O 39.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72 ℃ 延伸 1 min，72 ℃終延伸7 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化。純化后的PCR產(chǎn)物，使用測序儀ABI3730-XL進行DNA測序。用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI16S數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的初篩（表1）

表1 不同菌株發(fā)酵物中四甲基吡嗪含量 (mg/L)

通過對高溫大曲的分離純化，共得到27株菌落和細(xì)胞形態(tài)不同細(xì)菌菌株。分別將其進行固態(tài)發(fā)酵初篩，測定其發(fā)酵產(chǎn)物中四甲基吡嗪的含量，篩選出高產(chǎn)四甲基吡嗪的菌株。由表1可知，L1、L11、M15、M12為高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株，其中M12和L1四甲基吡嗪產(chǎn)量更為突出，分別為150.92 mg/L、40.75 mg/L。

2.2 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的復(fù)篩（表2）

2.2.1 主成分分析

為了分析不同菌株的復(fù)篩發(fā)酵產(chǎn)物之間揮發(fā)性成分的差異，利用SIMCA-P 11.5軟件對64種香氣成分的含量進行主成分分析。主成分1的方差貢獻率為64.91%，主成分2的貢獻率為23.19%，兩者累計貢獻率已經(jīng)達(dá)到88.10%，基本上能反映樣品的揮發(fā)性成分信息，因此選取前2個主成分進行分析。

表2 不同菌株發(fā)酵物中香氣成分及其含量 (mg/100 mL)

圖1 揮發(fā)性成分主成分分析的得分散點圖

由圖1可知，4種菌株根據(jù)揮發(fā)性成分的得分明顯分為3個區(qū)域，表明4種菌株在主成分上能分開，揮發(fā)性成分之間存在明顯差異，其中L1和L11發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分有一定的相似性。

2.2.2 不同產(chǎn)吡嗪菌株揮發(fā)性物質(zhì)比較

分析不同產(chǎn)吡嗪菌株發(fā)酵物中揮發(fā)性物質(zhì)含量差異，并利用SPSS軟件進行差異性分析，結(jié)果見圖2，結(jié)合表2和圖2可知，M12和L1是產(chǎn)吡嗪較高的2株菌，其四甲基吡嗪的含量分別為18.90 mg/100 mL和5.53 mg/100 mL。M15和L11產(chǎn)吡嗪含量次之，且4株菌的吡嗪含量存在顯著差異（p＜0.05）。

圖2 不同菌株揮發(fā)性物質(zhì)含量比較

另外，在酯類方面，M12明顯比另外3株酯類含量高，酯類含量為25.99 mg/100 mL，L1酯類含量次之，為10.75 mg/100 mL，且M15、L11在酯類含量上不存在差異顯著（p＞0.05）。在醛類方面，M12和L1醛含量稍高于其他3株菌，分別為5.29 mg/100 mL、5.28 mg/100 mL，M15、L11在醛含量上不存在差異顯著（p＞0.05）。4株菌在酚含量上都比較低，之間不存在差異顯著（p＞0.05）。此外，在高級醇方面，L11中高級醇含量最高，為5.74 mg/100 mL，M12和L1較低，分別為2.77 mg/100 mL、2.74 mg/100 mL。

2.2.3 復(fù)篩結(jié)果

M12、L1不僅產(chǎn)四甲基吡嗪能力較強，而且產(chǎn)酯能力也是較高的2株菌。酯類是白酒中種類和含量最多的揮發(fā)性物質(zhì)[11]，也是白酒香味成分中的主體成分和呈香成分[12]，其含量對白酒的品質(zhì)有重要影響。此外，在酚類、醛類上，M12、L1的含量較高。白酒中酚、醛主要來自于醇的轉(zhuǎn)化[13]，含量雖然很低，但對酒的品質(zhì)有很大影響[14]。最后，M15、L11中高級醇比M12、L1高。高級醇是3個碳原子以上的一元醇類物質(zhì)的總稱[15]，適量的高級醇可以使酒體豐富[16]，當(dāng)白酒中高級醇含量過高，不僅會導(dǎo)致辛辣苦澀，給酒帶來不良影響，且對人體有危害作用，是引起飲后上頭、口干的原因之一[17]。綜合考慮，既保證四甲基吡嗪的產(chǎn)量，又可降低對其他揮發(fā)性物質(zhì)的影響，最終選擇M12、L1為目標(biāo)菌株。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

對篩選出的菌株M12、L1采用點接法接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，觀察其菌落形態(tài)特征，結(jié)果見圖3。菌株M12菌落呈白色橢圓形，邊緣不整齊，表面平整干燥，附著性強。經(jīng)染色后，細(xì)胞形態(tài)為細(xì)長桿狀。L1菌落為圓形，白色透明，邊緣不整齊，表面呈突起的圓形，有黏性，濕潤。經(jīng)染色后，細(xì)胞形態(tài)為短粗桿狀。

圖3 菌株M12(a)和L1(b)的菌落形態(tài)以及M12(c)和L1(d)的細(xì)胞形態(tài)

2.3.2 菌株的分子鑒定

將菌株M12、L1的16 SrDNA進行PCR擴增，然后將擴增產(chǎn)物進行序列測序，將測序得到的序列在NCBI中比對分析，獲得與測序菌株序列相近種、屬的序列。通過Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4。菌株M12與Bacillus licheniformis相似性達(dá)99%，鑒定為Bacillus licheniformis。菌株L1與Bacillus siamensis相似性達(dá)99%，鑒定為Bacillus siamensis。

圖4 菌株M12和L1 16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論

通過固態(tài)發(fā)酵從高溫大曲中篩選出4株高產(chǎn)四甲基吡嗪的細(xì)菌菌株，將其模擬大曲生產(chǎn)發(fā)酵，測定發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性成分。氣相色譜共檢測到64種揮發(fā)性成分，經(jīng)主成分分析，得到2個主成分，4種菌在主成分上可以明顯的區(qū)分出來。其中M12和L1不僅產(chǎn)吡嗪能力較強，產(chǎn)酯能力也較另外2株菌強，而且M12、L1在酚類、醛類上的含量是最高的。此外M15、L11中高級醇含量都比M12、L1高。經(jīng)多方面分析，故M12、L1更適合應(yīng)用于工廠實踐生產(chǎn)。經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子鑒定，確定M12為Bacillus licheniformis，L1 為Bacillus siamensis。關(guān)于生產(chǎn)實踐利用，則還需進行菌株發(fā)酵特性實驗，作進一步的研究探討。