周 曼，鄧良偉，楊紅男，劉 刈，蒲小東，陳子愛(ài)，李和平，李揚(yáng)眉

（1.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所，成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水利水電學(xué)院，四川 雅安 625014）

沼氣發(fā)酵技術(shù)是處理畜禽糞污的重要手段，在消納有機(jī)廢棄物、保護(hù)環(huán)境的同時(shí)，能生產(chǎn)可再生能源甲烷和有機(jī)肥，因此受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注[1-2]。

溫度是影響厭氧微生物及沼氣發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵因素。通常溫度越高，微生物活性越高，相應(yīng)地，沼氣發(fā)酵分為常溫（15～25℃）、中溫（35～37℃）、高溫（50～60℃）三個(gè)溫度范圍。迄今為止，大多數(shù)沼氣發(fā)酵系統(tǒng)在中溫范圍運(yùn)行。在厭氧微生物生長(zhǎng)范圍內(nèi)，一般溫度每升高10℃，沼氣發(fā)酵反應(yīng)速度增加約一倍。當(dāng)溫度低于最優(yōu)溫度，每下降1℃，沼氣發(fā)酵速率下降11%[3]，如果發(fā)酵液溫度突然變化超過(guò)3℃，污泥的活性會(huì)顯著降低[6]。具體到每種發(fā)酵原料，受溫度影響也不相同。例如，在10、15、20、25、30 ℃和35℃溫度下豬場(chǎng)廢水沼氣發(fā)酵最大容積產(chǎn)氣率分別是0.071、0.271、1.173、1.948、2.196 L·L-1·d-1和 2.871 L·L-1·d-1[4]?？捎脺囟然钚韵禂?shù)（θ值）定量反映溫度對(duì)沼氣發(fā)酵的影響，在15～20℃范圍θ值最高為1.332，20～25、25～30℃和30～35℃分別為1.043、1.041 和 1.028[5]。

脫氫酶和輔酶F420是產(chǎn)甲烷菌代謝途徑兩種重要輔酶，其在微生物體內(nèi)或者污泥樣品內(nèi)含量可以用來(lái)衡量活性微生物量的大小以及該污泥樣品對(duì)某種有機(jī)物的降解活性。在乙酸、丙酸、乳酸和丁酸對(duì)沼氣發(fā)酵過(guò)程的脅迫作用中，脫氫酶的活性可反應(yīng)活性污泥的活性變化[7]。從不同的膜載體對(duì)牛糞厭氧發(fā)酵的影響可看出，輔酶F420在某種程度上可以作為產(chǎn)甲烷菌數(shù)量變化的參考[8]，輔酶F420的相對(duì)濃度與甲烷產(chǎn)生速率呈線性相關(guān)，這進(jìn)一步表明輔酶F420可以表示特定生物反應(yīng)器的產(chǎn)甲烷活性[9]。

相對(duì)于濕式沼氣發(fā)酵，干式發(fā)酵具有沼渣沼液濃度高、數(shù)量少、容易利用等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。但是，干發(fā)酵過(guò)程傳質(zhì)困難，隨總固體（TS）濃度增加，傳質(zhì)能力急劇降低，TS濃度為8%和25%發(fā)酵液的有效擴(kuò)散系數(shù)數(shù)值分別僅為水的參考值的1/50和1/185[12]。各種中間代謝產(chǎn)物和微生物的交流受到嚴(yán)重限制，加劇氨抑制和脂肪酸積累，從而進(jìn)一步使微生物活性受到抑制。豬糞濕式和干式沼氣發(fā)酵都可以順利啟動(dòng)并良好運(yùn)行[13-14]，但雞糞比牛糞、餐廚廢棄物、豬糞和活性污泥都有更高的氮含量[15]，一般采用濕式沼氣發(fā)酵，進(jìn)料TS為8.93%，早期總氨氮（TAN）濃度低于5000 mg·L-1，原 料 沼 氣 產(chǎn) 氣 率 為 0.35～0.4 L·g-1VSadded，但隨發(fā)酵進(jìn)行，TAN濃度增加，沼氣產(chǎn)量降低[16]，因?yàn)殡S溫度增加，游離氨濃度增加，導(dǎo)致氨氮抑制加重，使得沼氣產(chǎn)量減少。雞糞干式沼氣發(fā)酵很多嘗試都最終失敗[17]。鑒于此，本文研究了雞糞中溫沼氣干發(fā)酵的啟動(dòng)，并考察了啟動(dòng)階段溫度變化對(duì)產(chǎn)氣性能的影響，通過(guò)分析發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)氣率、總氨氮、揮發(fā)性脂肪酸、脫氫酶活性和輔酶F420濃度變化反映污泥活性，以期為雞糞沼氣發(fā)酵工程的啟動(dòng)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雞糞取自四川省雅安市某規(guī)模蛋雞場(chǎng)，取回當(dāng)日新鮮雞糞置于4℃冰箱冷藏備用。接種污泥取自四川省某規(guī)模豬場(chǎng)正常運(yùn)行的廢水處理沼氣工程，取回后35℃水浴培養(yǎng)至無(wú)殘余產(chǎn)氣備用。底物和接種污泥理化指標(biāo)見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)裝置

干式沼氣發(fā)酵試驗(yàn)裝置為具有三通出口的玻璃瓶，總?cè)莘e2500 mL（有效容積1600 mL），用帶有進(jìn)料管、出料管和排氣管的橡皮塞密封（圖1）。集氣瓶為總?cè)莘e為2500 mL玻璃瓶，用帶有進(jìn)氣管和排水管的橡皮塞密封，沼氣發(fā)酵瓶和集氣瓶通過(guò)橡皮管連接。測(cè)量集氣瓶排出水的容積，即為沼氣產(chǎn)量。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用污泥全接種，即將1600 mL厭氧污泥裝入沼氣發(fā)酵瓶。反應(yīng)器設(shè)計(jì)容積負(fù)荷為1.1 g TS·L-1·d-1，進(jìn)料TS濃度為22.09%，水力停留時(shí)間為160 d。即每日進(jìn)料10 mL，進(jìn)料之前先排出發(fā)酵殘余物10 mL。共5組反應(yīng)器，每組2個(gè)重復(fù)。

初始5組反應(yīng)器均設(shè)置在35℃水浴連續(xù)培養(yǎng)，待出料pH、出料COD、日產(chǎn)氣量穩(wěn)定后，將其中4組反應(yīng)器分別轉(zhuǎn)移至15、20、25℃和30℃條件下進(jìn)行水浴培養(yǎng)，待降溫處理一段時(shí)間后，再次將4個(gè)降溫處理組反應(yīng)器升溫恢復(fù)至35℃培養(yǎng)條件。35℃溫度處理組反應(yīng)器為對(duì)照，始終保持發(fā)酵溫度不變。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中每日測(cè)沼氣產(chǎn)量和甲烷含量，每隔2 d測(cè)TAN、VFAs、脫氫酶活性和輔酶F420濃度。試驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)定接種污泥化學(xué)成分為C11.91H5.02O1.69NS0.18，雞糞化學(xué)成分為C16.05H29.35O3.06NS0.06。

表1 底物和污泥的基本性質(zhì)Table 1 Characteristics of substrates and inoculum sludge

圖1 沼氣發(fā)酵裝置示意圖Figure 1 Diagrammatic sketch of anaerobic reactor

1.4 分析方法

TS、VS測(cè)定采用重量法；pH值測(cè)定采用pHS-3C+酸度計(jì)；TAN測(cè)定采用納氏試劑分光光度法（HJ 535—2009）；TKN測(cè)定采用硫酸-過(guò)氧化氫消解-凱氏定氮法；VFAs成分測(cè)定采用氣相色譜儀Aglient 7820A GC火焰監(jiān)測(cè)器（Agilent Technologies，USA）；沼氣成分測(cè)定采用沼氣成分分析儀（BIOGAS 5000，Geotech，UK）；元素分析測(cè)定采用元素分析儀（CE In?struments，Milano，Italy）；脫氫酶活性測(cè)定以 2-3-5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）為底物，經(jīng)脫氫酶催化還原反應(yīng)后生成紅色產(chǎn)物TTCH2-trifenylforma?zane（TF），顏色的深淺反映脫氫酶活性的高低[18]；輔酶F420測(cè)定采用紫外分光光度法[19]。FA由公式（1）計(jì)算[20]：

式中：[NH3]為游離氨含量，mg·L-1；[TAN]為總氨態(tài)氮含量，mg·L-1；T 為發(fā)酵料液的溫度，K。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度變化對(duì)發(fā)酵運(yùn)行的影響

在厭氧生態(tài)系統(tǒng)中，產(chǎn)甲烷菌對(duì)溫度波動(dòng)比較敏感，發(fā)酵液溫度改變會(huì)導(dǎo)致污泥活性發(fā)生改變，產(chǎn)氣也隨之變化。如圖2所示，5組厭氧反應(yīng)器首先同時(shí)于35℃溫度下啟動(dòng)運(yùn)行，使用水浴鍋維持發(fā)酵溫度，每日進(jìn)出料，進(jìn)料TS濃度為22.09%，進(jìn)料負(fù)荷為1.1 g TS·L-1·d-1，容積產(chǎn)氣率逐漸穩(wěn)定在0.459～0.510 L·L-1·d-1之間。運(yùn)行至第6 d后，溫度突然下降至30、25、20℃和15℃時(shí)，相比35℃溫度處理組，30、25℃和20℃溫度處理組的容積產(chǎn)氣率分別降低27.2%、73.4%和95.3%，隨后產(chǎn)氣量逐漸小幅上升。15℃溫度處理組發(fā)生產(chǎn)氣停滯現(xiàn)象，超過(guò)10 d才恢復(fù)產(chǎn)氣。各溫度處理組在各自溫度條件下運(yùn)行12 d，第18 d溫度驟升恢復(fù)至35℃，15℃溫度處理組產(chǎn)氣量發(fā)生短暫停滯，20、25℃和30℃溫度處理組產(chǎn)氣量發(fā)生小幅降低，之后皆出現(xiàn)產(chǎn)氣上升的現(xiàn)象，25℃和30℃最早恢復(fù)到與35℃對(duì)照組產(chǎn)氣相當(dāng)?shù)臓顟B(tài)，15℃和20℃產(chǎn)氣量逐漸提升，最終在近10 d時(shí)也基本恢復(fù)到與35℃對(duì)照組相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)氣量。15℃和20℃產(chǎn)氣恢復(fù)較慢原因主要是由于低溫運(yùn)行時(shí)快速積累了較高的VFAs（圖3）。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)總VFAs構(gòu)成中乙酸、丙酸和丁酸含量分析發(fā)現(xiàn)，乙酸始終占總VFAs中絕對(duì)比例，對(duì)總酸大量積累有最大貢獻(xiàn)。脂肪酸大于4000 mg·L-1時(shí)發(fā)酵過(guò)程發(fā)生抑制[21]，在恢復(fù)到35℃時(shí)，15℃和20℃溫度處理組VFAs濃度分別達(dá)到5829 mg·L-1和7465 mg·L-1，遠(yuǎn)超過(guò)了抑制閾值，因此需經(jīng)歷更長(zhǎng)時(shí)間降解積累中間產(chǎn)物，故導(dǎo)致產(chǎn)氣率降低，隨VFAs濃度降低，產(chǎn)氣逐漸得以恢復(fù)。變溫處理期間，各溫度處理組TAN濃度在2700～3200 mg·L-1之間（圖4），35℃溫度處理組FA濃度最高為170 mg·L-1。FA 的 抑 制 閾 值 為 1100 mg·L-1（對(duì) 應(yīng) TAN 為3400 mg·L-1），低于此濃度，比增長(zhǎng)速率基本保持不變[21]。此過(guò)程TAN濃度在抑制閾值之下，F(xiàn)A濃度遠(yuǎn)低于抑制閾值。

圖2 容積產(chǎn)氣率和甲烷產(chǎn)率的變化Figure 2 Variations of methane yield and volumetric biogas production rate

圖3 總揮發(fā)酸濃度變化Figure 3 Variations of total volatile acid

試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在雞糞干發(fā)酵啟動(dòng)階段，因?yàn)檫\(yùn)行時(shí)間不長(zhǎng)，TAN尚未達(dá)到抑制產(chǎn)氣濃度，產(chǎn)氣效果主要受溫度影響。甲烷微生物對(duì)溫度變化非常敏感，尤其突然降低溫度使沼氣發(fā)酵微生物活性受限，微生物的生長(zhǎng)和代謝隨之降低，繼而導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物如VFAs積累，產(chǎn)氣能力降低。因此，為了保持厭氧反應(yīng)器高效穩(wěn)定的產(chǎn)氣性能，保持適宜、穩(wěn)定的溫度尤為重要。試驗(yàn)中較大幅度的溫度變化，并沒(méi)有對(duì)反應(yīng)器造成持續(xù)惡劣的影響，重新恢復(fù)到35℃時(shí)，經(jīng)歷一定時(shí)間，各溫度變化組最終產(chǎn)氣量均恢復(fù)到與35℃產(chǎn)氣量相當(dāng)水平。這說(shuō)明沼氣發(fā)酵微生物對(duì)一定溫度變化范圍波動(dòng)具有一定的適應(yīng)性，足夠的時(shí)間范圍內(nèi)可以順利恢復(fù)。

2.2 溫度變化對(duì)沼氣產(chǎn)量和甲烷含量的影響

沼氣產(chǎn)量和甲烷含量是評(píng)價(jià)沼氣工程發(fā)酵效果的重要指標(biāo)，而原料的化學(xué)成分決定了潛在沼氣產(chǎn)量和氣體成分。已知原料的化學(xué)成分可以評(píng)估理論甲烷產(chǎn)量。

本研究底物雞糞的化學(xué)成分為C16.05H29.35O3.06NS0.06，在標(biāo)準(zhǔn)溫度和氣壓下（STP，0℃、760 mmHg），由公式（2），可計(jì)算得到理論原料沼氣產(chǎn)率和原料甲烷產(chǎn)率，分別為1.42 L Biogas·g-1VS和0.85 L CH4·g-1VS，理論甲烷含量60.0%。如圖2所示第（Ⅱ）階段，溫度驟降，不同溫度處理組產(chǎn)氣性能受到不同程度影響。15、20、25、30℃和35℃溫度處理組最大原料甲烷產(chǎn)率分別為0.011、0.074、0.211、0.261 L CH4·g-1VS和0.294 L CH4·g-1VS。35℃溫度處理組產(chǎn)氣率最高，但也僅為理論值的35%。實(shí)際值較理論值偏低，主要原因是底物降解不完全。一方面底物中含有一部分難降解有機(jī)物，這部分有機(jī)物未降解。另一方面，底物可利用有機(jī)物轉(zhuǎn)化不完全，未轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)化為沼氣底物排出反應(yīng)器。

圖4 氨氮和游離氨濃度變化Figure 4 Variations of TAN and FA

容積產(chǎn)氣率是沼氣工程設(shè)計(jì)和投資核算的基礎(chǔ)參數(shù)。變溫處理期間，15、20、25、30℃和35℃溫度處理組最大容積沼氣產(chǎn)氣率分別為0.017、0.126、0.357、0.442 L·L-1·d-1和0.493 L·L-1·d-1。35 ℃溫度處理組最大容積沼氣產(chǎn)氣率最高。容積產(chǎn)氣率不隨溫度而線性增加可能是由微生物對(duì)底物的飽和程度決定的[5]。

由公式（3）計(jì)算可得，忽略水蒸汽氣壓的影響，不同溫度下不同干燥氣體理論產(chǎn)率和實(shí)際產(chǎn)率差異不大。變溫處理過(guò)程中，沼氣成分發(fā)生變化，隨溫度增加，甲烷含量增加。35、30、25、20℃和15℃溫度處理組的平均甲烷含量分別為60%、59%、57%、53%和50%。15℃和20℃的甲烷含量要明顯低于25～35℃，說(shuō)明低溫條件VFAs積累，造成酸化，酸化細(xì)菌活性相對(duì)較高，產(chǎn)甲烷細(xì)菌活性降低，產(chǎn)甲烷階段比產(chǎn)酸階段受到更大影響，產(chǎn)甲烷菌對(duì)低溫更敏感。

變溫過(guò)程中，不同溫度條件下產(chǎn)氣性能的差異可能是由于微生物群落結(jié)構(gòu)和活性隨溫度梯度的變化而急劇變化，相應(yīng)的導(dǎo)致了消化性能的變化，即甲烷產(chǎn)量、VFAs濃度等發(fā)生變化。對(duì)于溫度變化造成的影響并未見(jiàn)較多報(bào)道，有學(xué)者研究了豬糞濕發(fā)酵反應(yīng)器從35℃降低至30℃，并再次恢復(fù)到32℃兩個(gè)溫度脈沖過(guò)程，原料甲烷產(chǎn)率均有所降低，但較快恢復(fù)到和35℃相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)氣率，結(jié)果并未造成較大的影響[22]。Lin等[23]研究了在不同溫度下微生物基因表達(dá)和沼氣生產(chǎn)的關(guān)系，每日甲烷產(chǎn)量和總產(chǎn)氣量隨溫度（25、35、45℃和50℃）升高而增加。微生物調(diào)節(jié)的溫度影響厭氧消化系統(tǒng)性能，其運(yùn)行機(jī)制還不甚清楚。一種可能是由于通過(guò)增加微生物群落的α多樣性和提供更多功能途徑的潛在相關(guān)活動(dòng)和代謝網(wǎng)絡(luò)的活動(dòng)，并增加微生物群落整個(gè)活動(dòng)，尤其是產(chǎn)甲烷活動(dòng)，從而提高厭氧消化過(guò)程的力量和效率[23]。另一種可能通過(guò)減少功能性途徑的多樣性（α多樣性相反），但提高中心功能的途徑，使大部分細(xì)胞的活動(dòng)和資源投資于甲烷及相關(guān)途徑，提高轉(zhuǎn)換效率[24]。本試驗(yàn)變溫處理時(shí)間短，主要考察由于溫度變化造成的影響，各溫度處理組也可能尚未達(dá)到各自溫度條件下的穩(wěn)定運(yùn)行狀態(tài)，對(duì)于不同溫度條件對(duì)厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣性能的長(zhǎng)期影響需要更多試驗(yàn)研究。

2.3 酶活對(duì)產(chǎn)氣特性的反應(yīng)

脫氫酶作為一種胞內(nèi)酶與細(xì)胞內(nèi)的氧化磷酸化過(guò)程緊密相關(guān)，是反映沼氣發(fā)酵體系中微生物活性的一個(gè)重要指標(biāo)[25-26]。由圖5a可以看出，與35℃時(shí)相比，溫度驟降為15、20、25℃和30℃的酶活分別降低了65.52%、50.63%、42.53%和36.78%。各溫度處理組在穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)，隨溫度降低，脫氫酶也呈現(xiàn)較低的活性，第12 d，15、20、25、30℃和35℃的酶活性分別為 45.36、79.2、158.4、365.2 TF μg·mL-1·h-1和 383.2 TF μg·mL-1·h-1。運(yùn)行至第18 d，溫度再次升高，酶活力逐漸上升，試驗(yàn)運(yùn)行至第30 d到第40 d，各溫度處理組間酶活性差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

在厭氧消化產(chǎn)甲烷的代謝途徑中有兩類重要的輔酶，一是作為甲基載體的輔酶，二是作為電子載體的輔酶。輔酶F420屬于后者，是產(chǎn)甲烷菌特有的輔酶，其濃度可以反映厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷的活性[9]。由圖5b可以看出，與35℃時(shí)相比，溫度驟降為15、20、25℃和30℃時(shí)F420酶活分別降低了89.10%、79.15%、71.56%和29.86%。隨溫度降低，各溫度處理組輔酶F420也呈現(xiàn)較低的活性，第 12 d，15、20、25、30 ℃和35 ℃的酶活性分別為0.16、0.34、1.11、1.77 μmol·L-1和 1.89 μmol·L-1。運(yùn)行至第 18 d，溫度再次升高，酶活力逐漸上升，試驗(yàn)運(yùn)行至第30 d到第40 d，對(duì)各溫度處理組間酶活性差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

圖5 脫氫酶活性和輔酶F420濃度變化Figure 5 Variations of dehydrogenase activity and F420concentrations

圖6 脫氫酶和輔酶F420與甲烷產(chǎn)率的線性相關(guān)性Figure 6 The linear correlation of dehydrogenase activity and F420concentrations with methane yield

也有研究表明輔酶F420作為厭氧活性污泥指標(biāo)可能是不可行的[19]，即在同種污泥的不同時(shí)期，輔酶F420的含量與最大甲烷產(chǎn)率之間存在著一定的正相關(guān)，但不為線性相關(guān)。在本試驗(yàn)中輔酶F420相對(duì)濃度與甲烷產(chǎn)率呈現(xiàn)一定的線性相關(guān)性的原因一種可能是由于同種污泥的不同運(yùn)行時(shí)期，產(chǎn)甲烷菌的種類及其各自所占的比例不同，而導(dǎo)致不同的甲烷菌中輔酶F420的含量不同；另一種可能是輔酶F420作為產(chǎn)甲烷菌所特有的輔酶[27]，其活性變化與蛋白質(zhì)含量呈線性相關(guān)[19]，且一般認(rèn)為輔酶F420是由嗜氫產(chǎn)甲烷菌分泌的[28]。雞糞中未降解蛋白質(zhì)含量較高，其沼氣發(fā)酵過(guò)程中以耐受氨氮的嗜氫甲烷菌為主導(dǎo)[16]，故而呈現(xiàn)更為敏感的變化。

3 結(jié)論

（1）采用污泥全接種方式，35℃雞糞中溫干式沼氣發(fā)酵可以順利啟動(dòng)，揮發(fā)酸沒(méi)有達(dá)到抑制濃度，氨氮也尚未達(dá)到抑制水平，溫度是影響產(chǎn)氣性能的主要因素。

（2）沼氣發(fā)酵微生物對(duì)溫度變化敏感。雞糞中溫干式沼氣發(fā)酵啟動(dòng)過(guò)程中，溫度變化會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)氣量降低，較低溫度條件下VFAs快速大量積累，對(duì)產(chǎn)氣影響較大。沼氣發(fā)酵微生物對(duì)一定范圍的溫度變化具有一定的適應(yīng)性，足夠的時(shí)間內(nèi)可以順利恢復(fù)，但溫度變化導(dǎo)致厭氧干發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)。

（3）相比脫氫酶，輔酶F420的活性變化與甲烷產(chǎn)率變化趨勢(shì)更相似，有更好的線性擬合關(guān)系，能反映雞糞中溫干式沼氣發(fā)酵啟動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)氣性能的變化，可作為厭氧干發(fā)酵啟動(dòng)階段或進(jìn)行變溫管理中監(jiān)測(cè)污泥活性的指標(biāo)。