肖詩琦，宋 收，陳曉明，2*，戚 鑫，張祥輝，田 甲，黃 森，董發(fā)勤

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學(xué)國防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621010）

隨著核電工業(yè)的快速發(fā)展，我國對(duì)天然鈾的需求量劇增。鈾礦冶煉和應(yīng)用過程中，產(chǎn)生了大量含放射性鈾等重金屬的尾礦渣、尾礦水，使得土壤受到了放射性重金屬的污染[1-2]。土壤被鈾污染后，一方面具有放射性污染，通過放射性衰變產(chǎn)生射線穿透機(jī)體組織，損害細(xì)胞，另一方面，可通過呼吸系統(tǒng)或食物鏈等途徑進(jìn)入人體，造成損害更大的內(nèi)照射損傷，嚴(yán)重威脅人類身體健康[3-6]。因此，有必要考察鈾污染對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的影響。

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，80%～90%的土壤相關(guān)功能都被微生物所調(diào)節(jié)，包括土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，系統(tǒng)的穩(wěn)定性及抗干擾能力等[7]。在生物學(xué)上微生物被認(rèn)定為最敏感的土壤質(zhì)量指標(biāo)，其能直接反映污染物的毒性及潛在影響[8-10]。其中真菌構(gòu)成了土壤的大部分微生物生物量，其具有分解有機(jī)質(zhì)、為植物提供養(yǎng)分的功能，是生態(tài)系統(tǒng)健康的指示物[11]。此外真菌可通過不同機(jī)制對(duì)重金屬產(chǎn)生耐性，包括細(xì)胞外金屬吸附和沉淀、細(xì)胞內(nèi)/胞外酶的產(chǎn)生、金屬與細(xì)胞壁的結(jié)合及細(xì)胞內(nèi)的吸附和絡(luò)合等[12]。因此，對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的研究能為評(píng)估和修復(fù)鈾污染生態(tài)環(huán)境提供一定的理論參考。

高通量測序具有高效、準(zhǔn)確、信息量豐富等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物群落研究中。Wu等[13]利用高通量測序技術(shù)，分析了電子污染回收區(qū)中土壤理化性質(zhì)及重金屬對(duì)微生物群落組成和多樣性的影響，結(jié)果表明土地使用模式會(huì)改變微生物群落組成，并且汞是改變微生物群落多樣性最主要的因子。Guo等[14]利用高通量測序技術(shù)揭示了重金屬污染土壤中微生物群落的變化，并獲得重金屬敏感菌及耐性菌。這種技術(shù)為研究環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)提供了大量的信息?；诖耍狙芯坎捎酶咄繙y序研究了真菌群落組成及多樣性，比較不同鈾濃度處理后土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異，為鈾污染土壤生態(tài)質(zhì)量評(píng)估及修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預(yù)處理

供試土壤采自西南科技大學(xué)校園內(nèi)無污染、植被肥沃的暗棕壤，土壤基本理化性質(zhì)見表1。采樣方法：在1 m2內(nèi)采用5點(diǎn)法取樣，采樣時(shí)先鏟去地表植物，刮掉5 mm厚的表層土壤，挖取直徑為20 cm的土坑，取樣深度為6～10 cm。土壤采集后經(jīng)過篩、去除雜質(zhì)等前處理。土壤脅迫處理采取向供試土壤中添加外源鈾的形式，樣品采用培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中25 g濕土。選用醋酸雙氧鈾[UO2（CH3COO2）2·2H2O，分析純，湖北楚勝威化工有限公司]，以純鈾計(jì)，配制成1 g·L-1鈾溶液并以其為母液進(jìn)行脅迫處理。外源鈾脅迫濃度為2、5、10、20、50、100 mg·kg-1，依次記為U2、U5、U10、U20、U50和U100。以原始土壤作為空白對(duì)照，記為U0。處理后的土壤放置在25℃下進(jìn)行培養(yǎng)，脅迫時(shí)間為15 d，土壤水分保持為田間持水量的60%。

表1 參試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of the soil

1.2 土壤DNA提取及高通量測序

采用OMEGA生物公司的E.Z.N.A.Soil DNA Kit抽提試劑盒提取土壤總DNA。擴(kuò)增選取真菌18S rRNA基因中的ITS1F-ITS2區(qū)段作為擴(kuò)增對(duì)象，采用引物：正向 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA-3′），反向 2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TG C-3′）。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXY?GEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物用Quanti?FluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，根據(jù)測得的DNA濃度，將樣品按1∶1比例混合，并振蕩混合均勻。MiSeq文庫構(gòu)建及Illumina高通量測序均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。將測得序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號(hào)SRR6921796、SRR6921807、SRR6921809、SRR6921813、SRR6921814、SRR6921851和SRR6921858。

1.3 數(shù)據(jù)分析

多樣性數(shù)據(jù)分析：對(duì)測得所有序列進(jìn)行OTU劃分，基于97%的相似性生成OTU表格，并構(gòu)建稀釋曲線。應(yīng)用Mothur軟件中的summary.single命令，計(jì)算Chao1、Ace、Shannon及Simpson 4種常用的生物多樣性指數(shù)。

分類學(xué)分析：使用Qiime平臺(tái)與RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析（置信度閾值為0.7），其中以Unite為數(shù)據(jù)庫，得到不同濃度鈾處理樣本的真菌在門和屬水平上的組成[15-16]。分類學(xué)數(shù)據(jù)庫中會(huì)出現(xiàn)一些分類學(xué)譜系中的中間等級(jí)沒有科學(xué)名稱，以norank作為標(biāo)記。分類學(xué)比對(duì)后根據(jù)置信度閾值的篩選，會(huì)有某些分類譜系在某一分類級(jí)別分值較低，以Unclassified標(biāo)記。

統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS 17.0中相關(guān)性分析考察鈾污染與真菌群落的關(guān)系。主成分分析（Principle com?ponent analysis）方法分析不同濃度鈾處理樣本間真菌群落的差異，采用R語言的Vegan包實(shí)現(xiàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤真菌多樣性指數(shù)

測序共得到有效reads 223 004條，平均每個(gè)樣品31 857條，其中平均堿基數(shù)高達(dá)7 771 584，平均片段長度為245 bp。采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量合理。如圖1所示，6個(gè)處理組的稀釋性曲線先呈直線上升隨后均趨于平坦，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，說明樣本量足以覆蓋所有真菌。并且樣本測序深度指數(shù)值均在99%以上（表2），進(jìn)一步證實(shí)本次測序結(jié)果能較好地代表樣本中微生物的真實(shí)情況。此外，還獲得不同樣本中真菌的Alpha多樣性指數(shù)值。Ace和Chao1指數(shù)均可用于估算群落中OTU的數(shù)目，兩種指數(shù)算法不同。該試驗(yàn)中，U10、U50和U100處理組的Chao1和Ace指數(shù)較對(duì)照組高，而U2、U5和U20處理組的較對(duì)照組低，其中U20處理組的兩種指數(shù)均最低。Shannon和Simpson均表征微生物群落多樣性。Shannon值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson值越大，群落多樣性越低。其中U20處理組的Shannon值最低，為1.86；U50處理組的Shannon值最高，為2.45。除U20處理組外，其余鈾處理組多樣性均高于對(duì)照組，該結(jié)果表明了鈾處理對(duì)土壤真菌多樣性有重要影響，并且20 mg·kg-1的鈾處理對(duì)土壤真菌影響較大。

圖1 鈾處理下土壤真菌的稀釋性曲線Figure 1 Rarefaction curves of soil fungi under uranium stress

表2 鈾處理下土壤真菌的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha index of soil fungi under uranium stress

2.2 土壤真菌群落組成

由圖2可知，檢測所得的OTU主要屬于4個(gè)門類，在整體水平接合菌門（Zygomycota，33.46%～73.36%）豐度最高，其次為子囊菌門（Ascomycota，24.56%～59.33%）、未被分類的真菌門Fungi_unclassi?fied（1.68%～7.86%）及擔(dān)子菌門（Basidiomycota，0.41%～3.53%）。與對(duì)照組相比，土壤在受到鈾脅迫后，接合菌門豐度下降，而子囊菌門豐度升高。與賀根和等[18]研究結(jié)果相似，子囊菌門在受到重金屬污染后豐度升高，表明子囊菌門真菌可能對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的耐受性。此外，未分類真菌在土壤中占有一定比例，并且其在外源鈾脅迫后的土壤中比例更高，因此未知真菌在土壤響應(yīng)鈾脅迫中具有重要意義。

圖2 鈾處理下土壤優(yōu)勢真菌的相對(duì)豐度Figure 2 Relative abundance of dominant fungi under uranium stress

圖3 鈾處理下土壤真菌群落聚類熱圖Figure 3 Heatmap of fungal community clusters under uranium stress

在屬水平（圖3），獲得前100種優(yōu)勢菌屬。豐度大于1%的菌屬有Mortierella、Ascomycota_unclassi?fied、Fungi_unclassified、Fusarium、Staphylotrichum、Basidiomycota_unclassified、 Montagnulaceae_unclassi?fied、Haematonectria、Podospora、Agaricales_unclassi?fied、Coniochaetaceae_unclassified、Pyrenochaetopsis和Entrophospora。其中Mortierella（33.46%～73.3%）和As?comycota_unclassified（15.89%～52.56%）顯著富集在各處理組中。與對(duì)照相比，鈾處理之后土壤中Mortierel?la的數(shù)量顯著下降，最多減少了40%；而Ascomyco?ta_unclassified明顯增加，最高增加了37%。

此外，在鈾處理后，部分優(yōu)勢菌種消失，同時(shí)也出現(xiàn)新的物種。其中Mortierellales_unclassified，Lophiosto?ma，Xylaria和Thelonectria僅在對(duì)照組中檢測到，而Trichosporon和Agaricomycetes_unclassified僅出現(xiàn)在各鈾處理組中。某些菌屬僅在某一鈾處理組中檢測到，如Glomus，F(xiàn)ellomyces，Rhizoctonia，Scutellinia和Occultifur僅存在于U100處理組中，Myxotrichaceae_unclassified和Eurotiomycetes_unclassified僅存在于U50組中，而Westerdykella和Sporobolomyces僅存在于U10處理組中。以上結(jié)果表明，土壤在受到鈾污染后，其真菌群落組成有明顯的變化。

2.3 鈾污染對(duì)土壤真菌群落的影響

圖4 鈾處理下土壤真菌群落PCA分析Figure 4 PCA analysis of fungal communities under uranium stress

利用主成分分析（PCA）考察不同濃度鈾污染土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。從圖4可以看出，第一主坐標(biāo)軸對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值為88.55%，第二主坐標(biāo)的貢獻(xiàn)值為7.72%。種類聚類中距離較近的樣本代表其真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，其中U10和U50鈾處理樣品的真菌結(jié)構(gòu)相似，U5和U100鈾處理樣品的真菌結(jié)構(gòu)相似，而U0對(duì)照組土壤中真菌結(jié)構(gòu)與鈾處理組相差較大。該結(jié)果表明了不同濃度的鈾污染對(duì)土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯影響。

本研究采用相關(guān)性分析，進(jìn)一步考察了鈾與優(yōu)勢菌屬間的關(guān)系。分析結(jié)果顯示多數(shù)優(yōu)勢菌屬與鈾無顯著關(guān)系，其中10種菌屬與鈾有顯著相關(guān)性，表明該10種真菌對(duì)鈾具有一定耐性。如表3所示，鈾與 Epicoccum、Agaricomycetes_unclassified和 Cylindro?carpon呈顯著相關(guān)（p＜0.05），與 Pseudeurotium、Glo?mu、Fellomyces、Rhizoctonia、Scutellinia、Occultifur和Cephaliophora呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。

3 討論

本研究采用Illumina MiSeq測序技術(shù)，從真菌群落多樣性、組成及結(jié)構(gòu)方面考察了不同濃度鈾污染對(duì)土壤微生物的影響。研究結(jié)果表明，不同濃度鈾處理后，土壤真菌群落豐度及多樣性均產(chǎn)生明顯變化。這可能是由于當(dāng)微生物群落暴露于重金屬污染程度改變的環(huán)境時(shí)，對(duì)重金屬毒性敏感的微生物顯著減少，而耐性微生物能很快適應(yīng)環(huán)境的變化[19]。此外，多數(shù)鈾處理組Shannon指數(shù)均高于對(duì)照組，表明鈾處理后真菌群落多樣性上升。與本研究相似，陳承利[20]發(fā)現(xiàn)重金屬污染使土壤中真菌增多，從而使其多樣性增加。而Jose等[21]研究發(fā)現(xiàn)高濃度重金屬污染會(huì)顯著降低細(xì)菌群落多樣性，這可能由于微生物對(duì)重金屬的響應(yīng)程度不同，其中真菌對(duì)重金屬耐性最高，其次是細(xì)菌和放線菌。

在群落組成上，真菌主要以Mortierella和Ascomy?cota_unclassified為主。其中Mortierella在鈾處理后，豐度下降。該結(jié)果與楊金水等[22]對(duì)鉛鋅礦區(qū)中土壤優(yōu)勢真菌的分析結(jié)果相似，Mortierella在低濃度重金屬污染樣品中豐度更高。同時(shí)，鈾脅迫后某些菌屬消失，也新增了部分菌屬。例如Xylaria僅在對(duì)照組中檢出而Trichosporon僅在鈾處理后出現(xiàn)。Fellomyces，Eurotiomycetes_unclassified和Sporobolomyces等僅存在于某一鈾處理組中。主成分分析結(jié)果表明，受到鈾處理后的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)更為相似。這些結(jié)果表明在鈾污染下，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。這可能是一定程度的鈾污染改變了原有群落內(nèi)部種群之間的競爭關(guān)系，導(dǎo)致原始種群失去了優(yōu)勢，而耐鈾微生物豐度增加并且某些微生物耐受鈾的過程產(chǎn)生的產(chǎn)物保護(hù)了其他種群的微生物，從而使鈾污染土壤的優(yōu)勢種群發(fā)生了明顯改變[23]。

表3 與鈾具有顯著相關(guān)性的優(yōu)勢菌屬Table 3 Significant correlation of dominant genera with uranium

本研究中獲得的對(duì)鈾具有耐性的真菌中Glomus、Rhizoctonia、Scutellinia、Agaricomycetes及 Cylindrocar?pon均為菌根真菌。該類真菌可與植物形成共生體系，是自然界普遍存在的微生物，其在鈾的固定和累積中起著一定的作用[24-25]。大量的研究證實(shí)[26-28]，在重金屬污染土壤中，菌根真菌一方面可以幫助植物吸收礦質(zhì)養(yǎng)分促進(jìn)其生長，從而增強(qiáng)植物對(duì)重金屬污染的耐受能力，另一方面菌根真菌自身能夠吸收、固持重金屬，從而在一定程度上降低土壤重金屬對(duì)植物的有效性和毒性[29-31]。鄭文君等[32]考察了接種Glomus sp.對(duì)蜈蚣草吸附鈾的影響。研究結(jié)果表明，接種該真菌有助于蜈蚣草吸附鈾并能減緩鈾對(duì)蜈蚣草的毒害。Vare[33]利用能量分散X射線考察了菌根真菌對(duì)重金屬的耐性機(jī)理，其在菌根真菌的液泡中發(fā)現(xiàn)有重金屬聚磷酸沉淀。其中磷酸根易與鈾螯合形成結(jié)晶體，并且其能主動(dòng)吸收鈾并能在細(xì)胞內(nèi)形成鈾的磷酸鹽沉淀[34]。本研究中真菌對(duì)鈾的耐性可能是由于鈾離子在進(jìn)入細(xì)胞后被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，或者在胞質(zhì)中與磷酸或其他易結(jié)合物質(zhì)結(jié)合形成沉淀。其中鈾的磷酸沉淀能大幅降低細(xì)胞中可溶性鈾的濃度，從而使細(xì)胞免受進(jìn)一步毒害?；诖?，利用微生物對(duì)鈾的耐受性機(jī)制和環(huán)境行為的特點(diǎn)來修復(fù)受鈾污染的環(huán)境前景廣闊，進(jìn)一步研究微生物的耐鈾機(jī)制有著重要的理論與實(shí)踐意義。

4 結(jié)論

（1）與對(duì)照組比較，鈾污染后真菌群落多樣性有明顯改變。鈾脅迫濃度為50 mg·kg-1時(shí)，土壤真菌多樣性最高，鈾脅迫濃度為20 mg·kg-1時(shí)，土壤真菌多樣性最低。

（2）鈾污染后土壤優(yōu)勢種群發(fā)生明顯改變。與對(duì)照組比較，Mortierella豐度最多減少了40%；而Asco?mycota_unclassified最高增加了37%。主成分分析結(jié)果表明，鈾處理組土壤真菌群落結(jié)構(gòu)均與對(duì)照組差異最大。

（3）相關(guān)性分析結(jié)果得到10種對(duì)鈾具有耐性的真菌，分別是 Pseudeurotium，Glomus，Agaricomycetes_unclassified，Epicoccum，F(xiàn)ellomyces，Rhizoctonia，Scutellinia，Occultifur，Cephaliophora和Cylindrocarpon。