史鼎鼎，梁小迪，徐少慧，蔣代華，黃智剛

（廣西大學農學院，南寧530004）

目前，重金屬污染是人類生活中極為重要的土壤環(huán)境問題之一，也是現今全球環(huán)境的一個熱點、難點問題[1]。重金屬污染具有隱蔽性、持久性以及難降解性等多種特性，同時還能夠進入到食物鏈中，對人類的健康及生態(tài)環(huán)境構成嚴重的危害[2]。在眾多重金屬元素中，Cd、Pb經常互相伴隨出現，從而導致鉛鎘復合污染的形成[3-4]。我國南方地區(qū)是較為重要的重金屬礦區(qū)，有色金屬礦較多，但由于礦產資源不合理的開采方式，直接導致礦區(qū)周邊的土壤及其環(huán)境受到不同程度的重金屬污染[5-6]。近年來，植物修復技術迅速發(fā)展，是一種應用前景廣闊的新技術。黑麥草（Lo?lium Perenne L.）屬早熟禾科黑麥草屬植物，一年生單子葉植物，具有生長速度快、分蘗多、須根發(fā)達、生物量大等特點，能夠提高土壤中多種元素的有效態(tài)含量，改善土壤的理化性質[7]，同時對重金屬具有很強的耐受性以及吸收、積累能力，是作為重金屬污染土壤修復較為理想的模式植物之一[8-9]。徐佩賢等[10]研究4種草坪植物對Cd的耐受性與積累特性，結果表明，黑麥草對Cd的耐受性僅次于高羊茅。李松克等[11]研究發(fā)現，6年種植黑麥草后，土壤中As、Pb、Cr、Cd 含量分別比種植初期降低了52.71%、45.12%、48.32%、59.15%，單項污染指數分別由種植前的2.67、0.31、1.92和3.48降低為1.26、0.17、0.99和1.42，表明重金屬污染土壤得到了不同程度的修復。

在前人的研究中，化學螯合劑能夠活化土壤中存在的重金屬，以促進植物的富集，進而強化植物對土壤中重金屬的吸收[12-13]。EDTA作為一種強大的螯合劑，能夠增加土壤溶液中的重金屬含量，有效促進植物對重金屬的吸收和轉運能力。王紅新等[14]研究結果表明，EDTA可促進對Pb的溶解并提高其在玉米地上部富集的能力。俞斌等[15]研究表明，EDTA的添加通過提高土壤中酸溶態(tài)鎳和鋅含量，促進甘蔗對鎳和鋅的吸收及向地上部位轉運。而土壤環(huán)境中存在著眾多微生物，種類繁多，其中細菌的數量最豐富、活動最旺盛，帶有電荷，可分泌出大量代謝產物，與植物的生長聯(lián)系密切，能夠促進植物生長，同時還可以通過多種方式來抑制重金屬的毒性，強化植物對土壤中重金屬的吸收效果[16]。細菌作為一種強化植物吸收重金屬的手段，可以在一定程度上緩解重金屬的毒性，促進植物的生長以及影響土壤中重金屬的生物有效性[17-18]。毛亮等[19]從重金屬污染土壤中分別篩出具有耐鉛性的綠色木霉菌和具有耐鎘性的淡紫擬青霉菌，研究數據表明添加菌后促進了龍葵的生長，并增加了龍葵整個植株體對Cd、Pb的吸收。

因此，本文針對具有南方代表性的主要土類之一——紅壤（占廣西總面積的35%），采用有機螯合劑EDTA和自行篩選出的耐性細菌J6菌，以一年生黑麥草為供試植物，通過盆栽試驗在重金屬復合污染狀況下，比較有機螯合劑——EDTA和天然生物螯合劑——耐性細菌促進黑麥草吸收重金屬Cd、Pb的差異，闡明耐性細菌與EDTA兩種方法強化植物富集重金屬的優(yōu)劣，為南方礦區(qū)重金屬污染土壤的生物修復提供一定的理論依據及技術參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

供試土壤為紅壤，采自廣西桂林市興安縣境內。該土壤的基本理化性質如表1所示。

1.1.2 供試植物

供試植物為邦德新一代寬葉型四倍體一年生黑麥草（Lolium Perenne L.）

1.1.3 供試細菌

試驗所用耐性細菌是本課題組分離篩選獲得的。篩菌土壤采自廣西崇左市大新縣鉛鋅礦區(qū)周邊被重金屬污染的5～20 cm深的表層土壤，該土壤的Cd、Pb含量分別為2 085.3、50.3 mg·kg-1，有效態(tài)Cd、Pb含量分別為192.6、17.5 mg·kg-1，屬于鉛鎘復合重度污染土壤。通過稀釋平板法篩選得到重金屬鉛鎘復合耐性菌株，取名為J6菌。

J6菌由上海生工生物有限公司進行菌種鑒定，經過16S rDNA序列測定，該菌是Rhodococcus baikonu?rensis，外形為圓形、乳白色、不透明、表面光澤、邊緣圓潤整齊、直徑為2.1～2.6 mm，革蘭氏陽性菌，對Pb的最高耐受濃度高達1200 mg·L-1，同時對Cd的最高耐受濃度為80 mg·L-1，在pH 3.0～11.0范圍內能夠正常生長，適應生長的酸堿度廣，對鹽也有一定的耐性。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 The basic physical and chemical properties of the tested soil

1.2 實驗設計

盆栽試驗于廣西大學農學院溫網室中進行，試驗所用塑料盆的上口直徑為24 cm，底部直徑為20 cm，高為20 cm。供試土壤過1 cm孔徑的土篩，混合后每盆裝土約5 kg。試驗采用雙因素完全隨機區(qū)組設計，因素一為鉛鎘污染濃度，設置6個水平，各個水平的Cd、Pb濃度分別為0、0 mg·kg-1；5、50 mg·kg-1；10、100 mg·kg-1；20、200 mg·kg-1；50、400 mg·kg-1；80、800 mg·kg-1，并依次以代號A1、A2、A3、A4、A5、A6表示。因素二為分別添加EDTA、接種J6菌，以空白為對照。共18個處理，每個處理重復3次。試驗前，使用尿素和 KH2PO4作基肥（N、P、K 的施入量分別為 0.200、0.158、0.200 g·kg-1）；鉛鎘系列濃度采取外源添加，以硝酸鉛和硫酸鎘形式配成溶液后采用噴霧的方式均勻加入土壤中，空白處理作對照。土壤含水量保持在田間持水量的60%，陳化一年。播種前，對黑麥草種子進行篩選、浸種消毒以及催芽等各種處理。播種時先用小鐵鍬取出約2 cm厚的紅壤表土，將萌芽種子均勻撒入盆中并用表土覆蓋后澆水以達到保持土壤含水量為田間持水量的60%的目的。生長約2～3周后間苗，每盆留苗200株。

1.3 樣品采集及測定

黑麥草種植3個月后收割，截取地上部并稱鮮質量。105℃殺青，65℃烘干至恒質量，稱其干質量，粉碎保存?zhèn)溆?；黑麥草根須部采集完根際土后，清洗后放置烘箱，105℃殺青，65℃烘干至恒質量，稱其干質量，粉碎保存?zhèn)溆谩?/p>

植株樣品，采用HNO3-H2O2消解-ICP-MS法測定重金屬Cd、Pb含量：稱0.100 0 g樣于50 mL消煮管中，加入8 mL HNO3（優(yōu)級純）后放置過夜。先石墨消煮爐80℃低溫消解，待管口冒棕色煙時，升溫至160℃消解至液體變?yōu)闇\黃色。取下冷卻后加入4 mL 30%H2O2，消解2 min后，消煮爐升溫至120℃，消煮30 min，再次冷卻加2 mL 30%H2O2，反復操作3次，第三次加2 mL 30%H2O2，待H2O2完全分解后，升溫至160℃繼續(xù)消解至液體清澈透白，剩余液體4 mL左右，即為消解完全。待測液轉移至50 mL容量瓶中，定容、過濾、保存。采用ICP-MS測定植物樣中的Cd、Pb含量。

根際土壤，濕法消煮-ICP-MS測定Cd、Pb全量：稱0.150 0 g根際土于50 mL消化管中，加5 mL HNO3（優(yōu)級純），放置過夜。用石墨消煮爐80℃低溫加熱2 h，升溫至120℃消解2 h，升溫至160℃消解至液體變?yōu)榈S色澄清，固體剩余量少且發(fā)白，管內外無棕色氣體附著，即為消解完全。冷卻后，同上述植物樣消解方法中加入30%H2O2，反復操作3次（每次加完H2O2后100℃消解1 h，升溫至120℃消解1 h）。待測液轉移至50 mL容量瓶中，定容、過濾，采用ICP-MS測定Cd、Pb含量。

采用DTPA浸提-ICP-MS法測定Cd、Pb有效態(tài)含量：稱2.00 g根際土于100 mL白色塑料瓶中，加入20 mL DTPA浸提劑，放置于25℃250 r·min-1的搖床上振蕩2 h，過濾，采用ICP-MS測定Cd、Pb含量

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。轉運系數=植物地上部Cd、Pb濃度（mg·kg-1）/植物地下部Cd、Pb濃度（mg·kg-1）[20]。

2 結果與討論

2.1 EDTA與J6菌對黑麥草生物量的影響

對于針對土壤重金屬污染問題的植物修復技術，在一定程度上會受到植物生物量的限制。由表2可知，在A1條件下，添加EDTA的黑麥草生物量低于其他兩組處理，且差異顯著。在重金屬Pb、Cd濃度較低，即A2、A3條件下，接菌處理的黑麥草生物量較高，差異顯著。而隨著Pb、Cd濃度的遞增，接菌處理的黑麥草生物量呈下降趨勢。與空白對照相比，EDTA處理的黑麥草總干質量降低，其中，根部干質量明顯下降，而黑麥草地上部鮮質量和干質量較高，且水分含量高。與接菌處理相比，在A1、A2、A3條件下，EDTA處理對黑麥草生物量的影響較大，抑制了其生長；隨著Pb、Cd濃度的提高，EDTA處理的黑麥草總生物量較高，但其對黑麥草根系的損害更為顯著。

江春玉等[21]篩選出一株對碳酸鉛、碳酸鎘活化能力最強的鉛鎘抗性細菌WS34，并且通過盆栽試驗驗證，菌株WS34能夠明顯提高供試植物的生物量。趙根成等[22]通過室內盆栽試驗研究表明，外源添加菌PSQ、Ts37、C13以及shf2對蜈蚣草生長有明顯促進作用，其生物量、根系活力及根系體積均有不同程度的增加。本實驗則表明：在A1、A2、A3條件下，接種J6菌能夠提高黑麥草的生物量，更好地促進黑麥草生長。而在重金屬高濃度，即A4、A5、A6條件下，接種J6菌后黑麥草生物量出現降低現象，原因可能是J6菌活化了土壤Pb、Cd離子[23]，促進了黑麥草對Pb、Cd的吸收，而吸收過高濃度的重金屬元素影響到葉綠體的相關酶活性，破壞相關結構及功能，導致葉綠素含量降低，植物的生物量相應減少[24-26]。在重金屬濃度梯度條件下，接菌處理后黑麥草的根系干質量均高于添加螯合劑EDTA，提高了3%～40%，表明接種J6菌比EDTA有利于黑麥草的生長、發(fā)育。

表2 兩種處理對黑麥草的生物量的影響Table 2 The weight of Lolium perenne in two treatments

2.2 EDTA與J6菌處理對黑麥草Pb、Cd含量的影響

圖1表示了添加EDTA與J6菌處理下黑麥草地上部以及根部的Pb、Cd含量的變化。圖1（a）與圖1（b）通過對比可知，黑麥草根部Pb濃度遠高于地上部Pb濃度。在無重金屬處理，即A1條件下，相比空白對照，EDTA處理、接菌處理的地上部、根部的Pb含量較低。在重金屬低濃度，即A2、A3、A4條件下，與EDTA相比，除A2條件中接菌處理地上部Pb含量較低外，接菌處理的地上部、根部Pb含量均較高，且A2、A3條件下的根部Pb含量差異顯著。在重金屬高濃度，即A5、A6條件下，與空白對照相比，接菌處理的根部差異顯著，分別高出 126、151 mg·kg-1；EDTA處理的黑麥草地上部Pb含量分別高出61、196 mg·kg-1，而根部Pb含量則較低，且差異顯著。結合圖1（c）與圖1（d）可知，黑麥草根部的Cd含量遠高于地上部的含量，與吸收Pb的規(guī)律相似。在無重金屬處理，即A1條件下，接菌處理的根部Cd含量略高于空白對照，在除A4條件的重金屬低濃度，即A2、A3條件下，接菌處理的Cd含量略高于空白對照，但A4條件下，接菌處理的Cd含量則較低，差異顯著。在A5條件下，接菌處理的地上部Cd含量高于空白對照，而根部Cd含量較低；在A6條件下，接菌處理的根部、地上部的Cd濃度均高于空白對照，且地上部Pb含量差異顯著。在重金屬Pb、Cd濃度梯度下，接菌處理的Cd含量均高于EDTA處理，且差異顯著。羅春玲等[27]研究表明黑麥草吸收的Pb、Cd離子主要儲存分布于根部，與本試驗結果相一致。趙根成等[22]研究表明，外源添加菌PSQ、Ts37、C13以及shf2有效提高了蜈蚣草積累砷的能力。本試驗結果也表明接種J6菌能夠促進黑麥草對Pb、Cd的吸收，提高黑麥草對Pb、Cd的積累能力，同時表明接菌處理的效果要優(yōu)于添加EDTA。

2.3 EDTA與J6菌處理對根際土鉛鎘含量的影響

圖1兩種處理下植物地上部及根系的Pb、Cd濃度Figure 1 The Cd or Pb concentration of plant aboveground and roots in two treatments

圖2 表示EDTA與J6菌處理對根際土Cd、Pb全量以及有效態(tài)的影響。由圖2（a）可知，在不同的重金屬濃度梯度下，EDTA處理比接菌處理的Cd全量接近于空白對照，接菌處理的Cd全量均較低，且與其他兩組差異顯著，同時隨著重金屬濃度的增加，差距也愈加明顯。由圖2（b）可知，與空白對照相對比，EDTA與接菌處理均較低，且差異顯著，Pb全量從低到高順序依次為接菌＜EDTA＜空白，同時隨著重金屬濃度的增加差距逐漸加大。在重金屬低濃度，即A2、A3、A4條件下，EDTA與J6菌處理的Pb全量差異不顯著；當重金屬濃度達到A5條件時，J6菌處理的Pb全量低于EDTA處理，且差異顯著。由圖2（c）可得，在不同重金屬濃度梯度下，各處理間均差異顯著，有效態(tài)Cd濃度從低到高順序依次為EDTA＜空白＜接菌。與空白對照相比，接菌處理分別提高了7%（A2）、13%（A3）、10%（A4）、11%（A5）、9%（A6），EDTA處理分別降低了 14%（A2）、45%（A3）、51%（A4）、6%（A5）、16%（A6）。由圖2（d）可知，重金屬濃度A3、A4條件下，與空白對照相比，J6菌與EDTA處理的紅壤有效態(tài)Pb濃度較低。在重金屬濃度為A5時J6菌處理降低的幅度最大，比空白對照降低了55%。但在重金屬濃度高達A6時，接種J6菌和添加EDTA的紅壤中有效態(tài)Pb都高于空白處理，分別高出21%、17%。

與添加螯合劑EDTA相比，接菌處理后根際土Pb、Cd全量較低而有效態(tài)含量較高，表明接種J6菌能夠更有效促進根際土的重金屬Pb、Cd形態(tài)的改變，提高有效態(tài)含量，更有利于黑麥草吸收重金屬Pb、Cd?？赡茉蚴牵环矫?，接種J6菌在一定程度上能夠提高黑麥草根際土壤微生物數量并改善群落結構，較好地維持根際土壤微生物群落多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能；另一方面，耐性菌株可能分泌的代謝產物（如有機酸）也能在一定程度上緩解過高濃度重金屬對黑麥草根系的傷害，維護黑麥草的根系活力和吸收能力。相關機理需進一步研究。

2.4 EDTA與J6菌處理對黑麥草Pb、Cd轉運系數的影響

影響植物吸收重金屬元素的主要限制因素包括重金屬元素從植物的根系向植物地上部轉移的能力，即轉運能力[28]。針對黑麥草地上部與根部的Pb、Cd含量的基礎分析，進一步探索黑麥草對Pb、Cd的轉運能力。圖3的（a）、（b）分別表示不同處理中黑麥草Pb、Cd轉運系數的影響。由圖3（a）可知，與空白對照相比，EDTA處理的Pb轉運系數較高，提高了22%～61%，有效提高了黑麥草Pb的轉運系數；接菌處理則較低，效果不明顯。由圖3（b）可知，相對于空白對照，EDTA和接菌處理較高且差異顯著。隨著重金屬濃度的增高，黑麥草Cd轉運系數呈先增后降趨勢，同時EDTA處理的變化幅度較大。在重金屬低濃度，即A2、A3、A4條件下，EDTA處理的Cd轉運系數最高，分別提高54%（A2）、55%（A3）、55%（A4），當重金屬濃度達到A5后接菌處理的Cd轉運系數則高于EDTA。

圖2 兩種處理下根際土的Cd、Pb含量Figure 2 The concentration of Cd and Pb on rhizosphere soil in two treatments

圖3 兩種處理對Pb、Cd轉運系數的影響Figure 3 The translocation of Pb and Cd in two treatments

3 結論

（1）在A1、A2、A3條件下，接種J6菌能夠提高黑麥草的生物量，更好地促進黑麥草生長。

（2）與添加螯合劑EDTA相比，接種J6菌能夠提高土壤中有效態(tài)Pb、Cd的含量，更好促進黑麥草對Pb、Cd的吸收。對比J6菌-黑麥草、EDTA-黑麥草兩種聯(lián)合修復Pb、Cd復合污染土壤體系的效果，耐性細菌J6菌較螯合劑EDTA對黑麥草吸收Pb、Cd的強化效應更為明顯。