張海利，王 濤，鄒路易，郁紅艷，顧文秀，滕 躍*

（1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

Cd污染主要來(lái)自于人類的農(nóng)業(yè)和工業(yè)活動(dòng)，如廢水灌溉、金屬礦石的開(kāi)采和冶煉等[1]。由于Cd具有生物毒性強(qiáng)、分布范圍廣、不能被生物降解且遷移性強(qiáng)等特點(diǎn)，使其易被植物吸收并積累，從而通過(guò)食物鏈富集，危害人類健康[2]。因此，Cd污染及其修復(fù)技術(shù)得到全球越來(lái)越多的關(guān)注[3]。

植物修復(fù)是一種成本低、環(huán)保的污染土壤修復(fù)技術(shù)，主要應(yīng)用超積累植物修復(fù)受污染土壤?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大量植物物種可超量積累重金屬[4-5]，但植物修復(fù)在實(shí)踐過(guò)程中仍存在局限性，其修復(fù)效率受多種因素的影響，如植物生長(zhǎng)緩慢、生物量小、對(duì)重金屬的耐受性有限等[6]，而使用植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤，是提高植物修復(fù)效率的有效方法[7-8]。

銅綠假單胞菌是一種具有金屬抗性的菌種，Zhang等[9]從煤礦區(qū)的污染土壤中分離出兩株銅綠假單胞菌菌株ZGKD5和ZGKD2，均對(duì)Cd、Cu、Zn、Ni和Pb表現(xiàn)出高耐受性。且大量研究表明，在植物修復(fù)盆栽實(shí)驗(yàn)中，銅綠假單胞菌可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高Cd積累量。例如，Liang等[10]的研究中，接種從重金屬污染的污泥中分離的銅綠假單胞菌顯著增強(qiáng)紫堇的Cd積累；Xie等[11]研究表明，接種銅綠假單胞菌ATCC 9027可緩解Cd的毒性，促進(jìn)苧麻生長(zhǎng)，并提高Cd積累；Biswas等[12]研究表明，從廢水中篩選出的銅綠假單胞菌KUJM具有多重重金屬抗性潛力，并促進(jìn)扁豆種子生長(zhǎng)，具有用于污染土壤植物修復(fù)的潛能。關(guān)于銅綠假單胞菌的研究均處于對(duì)植物生長(zhǎng)和積累總量的水平，而銅綠假單胞菌如何影響植物重金屬積累和分布的其他方面仍不確定。

Cd超積累植物龍葵生長(zhǎng)周期短、生物量大，且已被證明其耐受并吸收土壤中Cd[13]，具有良好的應(yīng)用前景[14-16]。研究表明，植物的金屬耐受性和解毒機(jī)制可通過(guò)亞細(xì)胞分布限制毒素或改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)[17-19]。然而，銅綠假單胞菌對(duì)龍葵中Cd積累和分布的影響尚無(wú)報(bào)道。本研究以龍葵和從Cd污染土壤篩選出的銅綠假單胞菌為研究材料，采用差速離心法和化學(xué)試劑逐步提取法，通過(guò)研究龍葵各部位中Cd的積累、亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)，來(lái)分析銅綠假單胞菌對(duì)其的影響，探討銅綠假單胞菌作用下龍葵對(duì)Cd的耐受機(jī)制，期望為龍葵在植物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽實(shí)驗(yàn)用土取自江蘇省江陰市農(nóng)田土，風(fēng)干后過(guò)2 mm篩。土壤理化性質(zhì)：pH 5.59，總氮 1 g·kg-1，有機(jī)質(zhì) 27.35 g·kg-1，速效磷 18.81 mg·kg-1，速效鉀75.46 mg·kg-1，Cd 2.64 mg·kg-1。

供試菌株為課題組從Cd污染土壤中已篩選出的Cd耐受性細(xì)菌，利用BLAST軟件將測(cè)得Cd耐受細(xì)菌基因序列與GenBank上相關(guān)的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，得出此菌與Pseudomonas aeruginosa銅綠假單胞菌同源性為99%。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置與處理

盆栽實(shí)驗(yàn)土壤的Cd含量設(shè)4個(gè)水平分別為0、25、50、100 mg·kg-1，不同Cd濃度的土壤分為接種和不接種銅綠假單胞菌兩種情況，共8個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。Cd以CdCl2溶液的形式加入已過(guò)篩的土壤中充分?jǐn)嚢瑁€(wěn)定2周后進(jìn)行高溫滅菌（121℃，30 min）處理。將滅菌后的土壤裝入塑料盆（直徑18 cm，高11.5 cm）中，每盆均裝土2 kg。挑選優(yōu)良的龍葵種子于70%的乙醇中浸泡30 min，無(wú)菌蒸餾水清洗3次，再于2%的NaClO2溶液中浸泡10 min后用蒸餾水洗凈，表面滅菌后種植盆中。接種組每周以細(xì)菌懸浮液的形式接種銅綠假單胞菌。將培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基中的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)移至盛有50 mL的LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于恒溫振蕩器（150 r·min-1，37 ℃）中振蕩48 h，富集后離心（6000 r·min-1，4 ℃）10 min收集細(xì)菌細(xì)胞，再用生理鹽水洗滌兩次獲得OD600值近似為0.6的接種物（約108CFU·mL-1），每盆接種5 mL做接種處理[11，20]。所有實(shí)驗(yàn)均在自然光照的溫室中進(jìn)行，60 d后收獲植物，自來(lái)水沖洗后，去離子水洗凈，吸干表面水分。

1.3 植物亞細(xì)胞組分的分離

植物亞細(xì)胞組分的分離采用差速離心法，參考Weigel等[21]的方法，并略加改動(dòng)。稱取根、葉鮮樣各0.2 g，加入 20 mL 預(yù)冷提取液[Tris-HCl（pH 7.5）50 mmol·L-1，蔗糖 250 mmol·L-1，DTT 1 mmol·L-1]，研磨勻漿后3000×g下離心15 min，沉淀為細(xì)胞壁組分（F1）；取上清液在12 000×g下離心30 min，沉淀為細(xì)胞器組分（F2）；上清液即為細(xì)胞可溶組分（F3）。全部操作在4℃下進(jìn)行。

1.4 植物Cd化學(xué)形態(tài)提取

植株Cd的化學(xué)形態(tài)分析采用化學(xué)試劑逐步提取法。準(zhǔn)確稱取根、葉鮮樣0.2 g，加入20 mL提取液研磨勻漿后轉(zhuǎn)入50 mL錐形瓶中，25℃恒溫振蕩22 h后，在5000×g下離心10 min，倒出上清液，再加入20 mL提取液，25℃恒溫振蕩2 h，在5000×g下離心10 min，倒出上清液，合并兩次上清液得該提取態(tài)組分樣品。沉淀加入下一種提取液進(jìn)行下一輪的提取。5種提取液依次為：（1）80% 乙醇（FⅠ），提取硝酸鹽/亞硝酸鹽，氯化物和氨基苯酚鎘等無(wú)機(jī)Cd；（2）去離子水（FⅡ），提取水溶性Cd，Cd-有機(jī)酸絡(luò)合物和Cd（H2PO4）2；（3）1 mol·L-1NaCl溶液（FⅢ），提取果膠和蛋白質(zhì)結(jié)合的Cd；（4）2% 醋酸（FⅣ），提取未溶解的鎘磷酸鹽，包括CdHPO4和Cd3（PO4）2；（5）0.6 mol·L-1鹽酸（FⅤ），提取草酸鎘；最后為殘留態(tài)（FⅥ）[22]。

1.5 Cd含量測(cè)定

將差速離心法和化學(xué)試劑逐步提取法分離得到的沉淀和上清液分別在電熱板上70℃加熱至近干，加入10 mL HNO3消煮至澄清，去離子水定容后使用ICP測(cè)定[23]。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19進(jìn)行單因素方差分析，使用Duncan新復(fù)極差法（SSR）在顯著水平小于0.05時(shí)作多重比較分析，使用Origin 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍葵對(duì)Cd的富集與特征

由表1可知，在未接種處理中，植株各部Cd含量均隨土壤中Cd濃度的增加而呈上升趨勢(shì)。植株莖和葉中富集的Cd含量隨土壤中Cd濃度的增加呈線性上升趨勢(shì)，兩者的富集能力并無(wú)下降或趨于飽和的現(xiàn)象。而龍葵根部在中低Cd濃度處理（0～50 mg·kg-1）時(shí)上升較快，在高Cd濃度處理（100 mg·kg-1）時(shí)趨于平緩。同時(shí)隨著土壤中Cd濃度增加，根-莖的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)逐漸增加，而莖-葉的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)逐漸降低。

接種銅綠假單胞菌可以促進(jìn)Cd更多地向葉轉(zhuǎn)移。隨著土壤中Cd濃度的增加，接種處理的龍葵葉中Cd含量為未接種的1.14～1.60倍。除土壤Cd濃度為50 mg·kg-1外，根的Cd含量較未接種處理降低8.23%～23.82%。在低Cd濃度（0～25 mg·kg-1）中，接種處理增加莖中Cd含量，而中高Cd濃度（50～100 mg·kg-1）中，接種處理減少莖中的Cd含量。同時(shí)隨土壤Cd濃度增加，接種處理的根-莖轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為未接種處理的1.13～1.22倍，莖-葉轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為未接種的1.02～1.68倍。即接種銅綠假單胞菌可以促進(jìn)植株內(nèi)Cd向葉的轉(zhuǎn)移，使得龍葵葉中對(duì)Cd的富集能力加強(qiáng)。

2.2 龍葵中Cd的亞細(xì)胞分布

由表2可知，各亞細(xì)胞組分的Cd含量隨著土壤中重金屬濃度的增加而增加，且大多數(shù)Cd存在于細(xì)胞壁和可溶性組分中。龍葵根部各亞細(xì)胞組分Cd的分配比例為F1＞F3＞F2，即根中Cd主要分布于F1（細(xì)胞壁）中，且在高濃度（100 mg·kg-1）下，接種處理的根部F1組分中Cd的分配比例為未接種的1.42倍。同時(shí)隨著土壤中Cd濃度的增加，接種處理的根部F2組分（細(xì)胞器組分）中Cd的分配比例較未接種減少4.37%～27.85%。葉的亞細(xì)胞組分中Cd的分配比例為F3＞F1＞F2，即葉中Cd主要分布于F3（可溶組分）中，且接種處理可顯著增加可溶組分中Cd的含量。同時(shí)與根部類似，接種處理中葉的F2組分（細(xì)胞器組分）Cd的分配比例較未接種減少12.90%～45.74%。

2.3 龍葵中Cd的化學(xué)形態(tài)分布

由圖1可知，龍葵根部Cd的化學(xué)形態(tài)分布受到土壤中Cd濃度的影響，且以醋酸、鹽酸提取態(tài)和殘留態(tài)Cd為主導(dǎo)。而醋酸、鹽酸提取態(tài)和殘留態(tài)Cd對(duì)植物沒(méi)有或基本沒(méi)有毒害作用，是不活躍的化學(xué)形態(tài)。由圖2可以看出，土壤中Cd濃度為中低濃度（0～50 mg·kg-1）時(shí)，接種處理增加各提取態(tài)Cd的含量；土壤Cd為高濃度（100 mg·kg-1）時(shí)，接種處理使根中各化學(xué)形態(tài)Cd含量急劇降低，并低于未接種處理（FⅢ除外）。

表1 龍葵根、莖、葉中的Cd含量Table 1 The content of Cd in roots，stems and leaves of Solanum nigrum

表2 Cd在龍葵根、葉中的亞細(xì)胞分布Table 2 Subcellular distribution of Cd in roots and leaves of Solanum nigrum

圖1 龍葵根系中各提取態(tài)Cd含量分配比例Figure 1 The percentage of each extractable forms of Cd in roots of Solanum nigrum

由圖3、圖4可知，隨著土壤中Cd濃度的增加，葉中各化學(xué)形態(tài)Cd含量呈增加趨勢(shì)，且以活躍態(tài)（乙醇、去離子水和氯化鈉提取態(tài)）Cd為主導(dǎo)。通過(guò)接種處理，非活躍態(tài)（醋酸、鹽酸提取態(tài)和殘留態(tài)）Cd在葉中分配比例較未接種呈增加趨勢(shì)。且葉中較活躍的氯化鈉提取態(tài)Cd分配比例較未接種減少20.17%～26.19%，活性較低的醋酸提取態(tài)Cd分配比例較未接種基本呈增加趨勢(shì)。即接種處理可促進(jìn)葉中Cd由活躍態(tài)向非活躍態(tài)的轉(zhuǎn)移。

3 討論

植物吸收何種化學(xué)形式的金屬以及植物如何將其分布到各組分中是影響重金屬污染土壤植物修復(fù)效果的重要因素之一。因此我們通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)，研究銅綠假單胞菌對(duì)超積累植物龍葵中Cd的亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)的影響。

研究表明，在Cd脅迫下，接種處理增加龍葵葉中的Cd含量，且龍葵根-莖、莖-葉的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為未接種的1.02～1.68倍和1.13～1.22倍，促進(jìn)植株中Cd由根部向地上部分的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)是評(píng)估超積累植物從土壤中攝取金屬和將其從根部向地上轉(zhuǎn)移能力的重要參數(shù)?？梢钥闯觯臃N銅綠假單胞菌促進(jìn)了龍葵Cd的轉(zhuǎn)移過(guò)程，有助于減少根中Cd的積累量，從而減少重金屬對(duì)根部的抑制作用，促使土壤中更多Cd被龍葵攝取，這與Shi等[24]的報(bào)道一致。

圖2 龍葵根部各提取態(tài)Cd含量Figure 2 The content of each extractable forms of Cd in roots of Solanum nigrum

龍葵對(duì)Cd的耐受性受其在植株中分布情況的影響。研究表明，Cd脅迫下，龍葵各部的Cd主要分布在細(xì)胞壁和可溶組分中。本研究中龍葵根部各亞細(xì)胞組分Cd含量的分配比例為F1＞F3＞F2，其中F1（細(xì)胞壁）組分的Cd比例最高為58.31%，同時(shí)在高Cd濃度（100 mg·kg-1）下，接種處理中根部細(xì)胞壁組分的Cd比例較未接種提高42.22%。因此，高Cd脅迫下，細(xì)胞壁的保護(hù)作用顯著。細(xì)胞壁是保護(hù)原生質(zhì)體免受重金屬毒性的第一道屏障，主要由纖維素、半纖維素、果膠和蛋白質(zhì)組成，表面傾向于帶負(fù)電[25]，是重金屬螯合的有效點(diǎn)位。而將Cd隔離于細(xì)胞壁中是植物耐受Cd的機(jī)制之一[26]。據(jù)報(bào)道，微生物的接種可以影響植物中Cd的亞細(xì)胞分布，如Wang等[27]的研究表明，與未處理的植物相比，接種Arbuscular Mycorrhizal增加了根細(xì)胞壁中37.2%～80.5%的Cd，且細(xì)胞器中的Cd水平降低，與我們的研究結(jié)果相似。接種處理促進(jìn)龍葵根中吸收的Cd更多地滯留在細(xì)胞壁上，進(jìn)入原生質(zhì)體的Cd又大多被主要由液泡組成的可溶性組分區(qū)隔化，從而細(xì)胞器組分的Cd比例較未接種降低，最高達(dá)27.85%。這減少了Cd對(duì)細(xì)胞的毒害作用，提高了龍葵對(duì)Cd的耐性。因此推測(cè)Cd脅迫下，接種銅綠假單胞菌可強(qiáng)化龍葵根中細(xì)胞壁的滯留作用，將Cd更多地存儲(chǔ)在植株生物活性較低的場(chǎng)所，從而達(dá)到對(duì)植株的保護(hù)。

圖3 龍葵葉片中各提取態(tài)Cd含量分配比例Figure 3 The precentage of each extractable forms of Cd in leaves of Solanum nigrum

圖4 龍葵葉片中各提取態(tài)Cd含量Figure 4 The content of each extractable forms of Cd in leaves of Solanum nigrum

不同化學(xué)形態(tài)的Cd具有不同的毒性程度和遷移能力，以乙醇、去離子水和氯化鈉提取的Cd具有較高的遷移能力并且對(duì)植物細(xì)胞的毒性高于醋酸、鹽酸提取態(tài)和殘留態(tài)的Cd[27]。本研究中，龍葵根部Cd化學(xué)形態(tài)分布以低活性態(tài)（醋酸、鹽酸提取態(tài)和殘留態(tài)）為主導(dǎo)，且土壤中Cd處于高濃度（100 mg·kg-1）時(shí)，接種銅綠假單胞菌使根中各化學(xué)形態(tài)Cd含量急劇降低，而葉中Cd含量顯著增高。由此可進(jìn)一步驗(yàn)證接種可促進(jìn)Cd由根向葉的轉(zhuǎn)移，提高龍葵對(duì)Cd的耐受性。

葉中各亞細(xì)胞組分Cd的分配比例為F3＞F1＞F2，其中F3組分（可溶組分）的Cd比例最高為73.01%。接種銅綠假單胞菌可增強(qiáng)葉中可溶組分的Cd含量，可溶組分主要由液泡組成，液泡已被認(rèn)為是重金屬積累的主要場(chǎng)所[26]，這種植物將吸收的Cd隔離于液泡中的過(guò)程稱為液泡區(qū)室化。因此可以認(rèn)為液泡區(qū)室化在龍葵葉對(duì)Cd的解毒機(jī)制中占有重要地位，且接種處理可促進(jìn)龍葵葉的液泡區(qū)室化作用。Wang等[27]的研究中，接種AM真菌處理的紫花苜宿在葉的可溶組分中積累更多的Cd，同我們的研究結(jié)果類似。同時(shí)，接種處理通過(guò)將Cd轉(zhuǎn)化為低活性形態(tài)，提高龍葵葉對(duì)Cd的耐受性，與Li等[28]的研究結(jié)果相似。在Cd脅迫下，接種處理增加植株葉中低活性形態(tài)（醋酸、鹽酸提取態(tài)和殘留態(tài)）Cd的比例，并且降低活性較高的氯化鈉提取態(tài)的Cd比例。這說(shuō)明Cd脅迫下，接種銅綠假單胞菌可以促使進(jìn)入龍葵葉的Cd由結(jié)合態(tài)更多地向活性更低且難溶于水的磷酸鹽、草酸鎘和殘?jiān)鼞B(tài)轉(zhuǎn)化，降低葉中Cd的毒性和遷移能力，從而減輕Cd對(duì)植物的毒害。

4 結(jié)論

接種銅綠假單胞菌提高了龍葵地上部分的Cd含量，促進(jìn)了Cd由根部向地上部分的轉(zhuǎn)移，增加了根中細(xì)胞壁組分和葉中可溶組分的Cd含量，同時(shí)降低根和葉中細(xì)胞器組分的Cd比例。此外，接種銅綠假單胞菌增加了葉中低活性形態(tài)Cd的比例。綜上所述，本研究表明，接種銅綠假單胞菌可通過(guò)改變Cd在植株中的分布和形態(tài)比例，促進(jìn)根的細(xì)胞壁滯留作用和葉的液泡區(qū)室化作用，促進(jìn)葉中Cd向活性更低的形態(tài)轉(zhuǎn)變，從而加強(qiáng)龍葵對(duì)Cd的耐受性。