馮菊梅

摘 要：目的 探討無創(chuàng)DNA基因檢測技術(shù)應用于產(chǎn)前篩查中的臨床價值及意義。方法 回顧性分析在我院2015年1月～2017年1月針對553例孕婦包括預產(chǎn)期年齡≥35歲的高齡產(chǎn)婦、唐篩結(jié)果為高風險、臨界風險或單項指標異常、超聲軟指標等孕婦。在充分知情同意，進行遺傳咨詢后選擇胎兒無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測，對檢測結(jié)果為高風險孕婦進一步進行染色體核型分析，對低風險孕婦進行電話追蹤隨訪。結(jié)果 553例孕婦外周血中，541例低風險，12例高風險，在高風險病例中7例提示21三體異常；2例提示18號染色體異常；1例提示13三體異常；2例提示胎兒性染色體異常；無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果為高風險的12例孕婦，均進行了羊水或臍血穿刺，7例21三體高風險中7例為47，XN，+21；2例18三體高風險者中1例為47，XN，+18，1例為46，XN；1例13三體高風險者中1例為47，XN，+13；2例性染色體異常中，1例為XXY，1例為45X。并對無創(chuàng)DNA檢測陰性的出生新生兒進行隨訪，未訴明顯異常。應用無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)診斷胎兒染色體疾病的敏感度為100.00%，特異度為99.91%，假陰性率為0，假陰性率為0.09%，無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測對21三體，13三體和性染色體的符合率為100.00%，對18三體的符合率為50.00%。結(jié)論 無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)在產(chǎn)前篩查中準確性高，假陽性和假陰性低的優(yōu)點，可提高產(chǎn)前篩查效率，減少染色體疾病患兒的出生，是快捷、安全、較介入性產(chǎn)前診斷易于接受、值得推廣的安全可靠的產(chǎn)前篩查方法，是今后發(fā)展的必然趨勢。但無創(chuàng)DNA檢測出的高風險孕婦，也必須進行羊水穿刺進一步確診。

關(guān)鍵詞：無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)；胎兒非整倍染色體疾病；無創(chuàng)產(chǎn)前篩查；臨床應用

中圖分類號：R440；R714.55 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.10.022

文章編號：1006-1959（2018）10-0073-04

Clinical Application of Noninvasive DNA Detection Technology in Prenatal Screening

FENG Ju-mei

（Guangyuan Maternal and Child Health Hospital，Guangyuan 628000，Sichuan，China）

Abstract：Objective To explore the clinical value and significance of noninvasive DNA gene detection technology in prenatal screening.Methods The retrospective analysis of 553 pregnant women，including pre maternity age≥35 years old，in our hospital in January 2017-January 2015，was high risk，critical risk or abnormal single index，and ultrasonic soft index.After fully informed consent，the prenatal detection of fetal noninvasive DNA was selected after genetic counseling.The chromosome karyotype analysis was carried out for the pregnant women with high risk，and the low risk pregnant women were followed up by telephone follow-up.Results In 553 pregnant women， 541 cases had low risk and 12 cases had high risk.Among the high risk cases，7 cases showed trisomy 21 abnormality，2 cases showed chromosome 18 abnormality，1 case showed 13 trisomy abnormality and 2 cases showed fetal sex chromosome abnormality.12 cases of high-risk non-invasive DNA test results were performed with amniocentesis or umbilical cord blood puncture.Among the 7 cases with high risk of trisomy 21，7 cases were of 47，XN，+21；Of the 2 cases of 18 trisomy high risk，1 were 47，XN，+18， 1 cases were 46，XN；1 cases 13 trisomy high risk patients，1 cases were 47，XN，+13；2 cases of sex chromosomal abnormalities，1 case was XXY and 1 was 45X.Follow up was also made for the neonates born with noninvasive DNA test，and no complaints were found.The sensitivity of the noninvasive DNA detection technique was 100.00%，the specificity was 99.91%，the false negative rate was 0，the false negative rate was 0.09%，the coincidence rate of noninvasive DNA prenatal detection for 21-3 body，13-3 body and sex chromosome was 100.00%，and the coincidence rate for 18-3 body was 50.00%. Conclusion Non invasive DNA detection technique has the advantages of high accuracy，false positive and low false negative in prenatal screening.It can improve the efficiency of prenatal screening and reduce the birth of children with chromosomal diseases.It is a safe and reliable prenatal screening method which is easy to be accepted and worthy of popularization.It is an inevitable trend in the future development.But noninvasive DNA detection of high-risk pregnant women must also be further diagnosed by amniocentesis.

Key words：Noninvasive DNA detection technology；Fetal aneuploidy diseases；Noninvasive prenatal screening；Clinical application

我國是出生缺陷的高發(fā)國。據(jù)2012年中國出生缺陷防治報告顯示，目前我國出生缺陷率約為5.6%，每年新增出生缺陷兒約90萬例，染色體疾病是最為嚴重的出生缺陷之一[1]。染色體異常造成的出生缺陷，存活下來的出生患兒多為終生殘疾或智力障礙，無法治愈，由此給社會造成了嚴重的經(jīng)濟負擔，對家庭造成的心理負擔和精神痛苦更是無法用金錢來衡量。染色體異常中最為常見，包括21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征及Turner綜合征，但迄今為止尚無有效治療手段。目前只能通過產(chǎn)前檢測預防患兒出生。臨床二級預防出生缺陷的主要方法是通過血清學篩查，但目前國內(nèi)臨床應用比較廣泛的孕中期產(chǎn)前篩查模式，是通過孕婦血清標志物水平間接反映胎兒情況，存在一定的假陽性和假陰性。 侵入性絨毛、羊水/臍血穿刺可能造成流產(chǎn)，感染等風險。 無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)的臨床開展，無疑是一個不錯的選擇，它具有無創(chuàng)優(yōu)點的同時，將對21、18、13三體綜合癥的檢出率提高到99%，作為一種新的近似于產(chǎn)前診斷的產(chǎn)前篩查技術(shù)，降低出生缺陷。對2015年1月～2017年1月我院產(chǎn)科進行無創(chuàng)DNA檢測的孕婦553例，進行檢測研究分析，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月～2017年1月在廣元市婦幼保健院產(chǎn)科進行無創(chuàng)DNA檢測的孕婦553例。年齡19～38歲，平均年齡（29.88±2.31）歲，孕周13～22+6周，平均孕周（6.50±1.89）周，單胎540例、雙胎13例。其中87例是產(chǎn)篩高風險含高齡預產(chǎn)期孕婦，年齡≥35周歲；243例臨界風險或單項指標異常；29例直接無創(chuàng)DNA檢測（含錯過唐篩時間者）；194例超聲染色體軟指標：如心室強回聲、NT異常、脈絡(luò)叢囊腫等。對產(chǎn)篩高風險的孕婦均得到遺傳咨詢及充分的告知并了解了無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)的局限性及風險性，并簽署知情同意書。對于無創(chuàng)DNA檢測出的高風險結(jié)果再進行羊水及臍血培養(yǎng)和核型分析以明確診斷。

1.2方法 標本采集采用EDTA真空采血管采集靜脈血5 ml，于2～8 C°保存，在2 h內(nèi)離心分離血漿提取DNA，在冷鏈條件下運送到四川省婦幼保健院檢驗中心進行胎兒DNA分析。實驗室提取母體外周血血漿中游離DNA片段，進行高通量測序，將每條DNA片段測序所得的序列與人類基因組圖進行比對，從中篩選每一條染色體上完全相吻合DNA序列總數(shù)。根據(jù)生物學統(tǒng)計原理，進行生物信息分析，確定胎兒染色體是否存在非整倍性變化的風險值。產(chǎn)后隨訪：對所有檢測結(jié)果呈陽性的孕婦，追蹤妊娠結(jié)局。同時對于檢測結(jié)果為陰性的孕婦做好觀察隨訪，確定無漏診率。

2結(jié)果

2.1唐氏篩查結(jié)果 2015年1月～2017年1月，在我院產(chǎn)科進行7853例孕婦唐氏篩查后共有高風險432例，高風險率5.50%，其中21三體337例，陽性率4.30%，18三體59例，陽性率0.75%，開放性神經(jīng)管缺陷（ONTD）高風險36例，陽性率0.45%。

2.2三種檢測方法結(jié)果對比 在所有無創(chuàng)DNA檢測的553例孕婦外周血中，541例提示低風險，12例提示高風險。高風險孕婦進行羊水/臍血的檢測結(jié)果為1例陰性，其余11例與無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果一致，見表1。

2.3無創(chuàng)DNA檢測異常結(jié)果與羊穿核型分析比較 12例無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測對21三體，13三體和性染色體的符合率為100.00%，對18-3體的符合率為50.00%，見表2。

2.4 隨訪結(jié)果 541例無創(chuàng)DNA檢測低風險的孕婦均已完成電話隨訪541例，已經(jīng)出生胎兒541例，目前家屬口述正常健康；12例無創(chuàng)DNA檢測高風險的孕婦依據(jù)染色體核形分析異常結(jié)果引產(chǎn)11例，其中7例胎兒明顯畸形，4例胎兒畸形不明顯的分別為47，XN， +21（3例）和45.X.（1例）。1例無創(chuàng)DNA檢測高風險的孕婦依據(jù)染色體核形分析1例為46XN，目前已經(jīng)出生胎兒家屬口述正常健康。應用無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)診斷胎兒染色體疾病的敏感度為100.00%（11/11），特異度為99.91%（540/541），假陰性率為0（0/553），假陰性率為0.09%（1/553），無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測對21三體，13三體和性染色體的符合率為100.00%，對18三體的符合率為50.00%。

3討論

染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常所致的疾病稱為染色體疾病，染色體疾病患者常表現(xiàn)為智力低下，發(fā)育遲緩，雖然醫(yī)療技術(shù)在不斷進步，但目前為止，染色體異常還沒有有效的治療方法[2]。胎兒染色體三體是孕婦需要進行產(chǎn)前篩查的一個主要原因，21三體是胎兒三體綜合征的最常見類型，每年的發(fā)病率為1/800-1/600[3]。本研究發(fā)現(xiàn)7例21三體綜合征，2例18三體綜合征，1例13三體綜合征，主要臨床表現(xiàn)為多發(fā)畸形，2例性染色體異常超聲下未見明顯異常。目前產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷成為避免染色體疾病患兒出生的重要手段之一。

近十余年，我國在預防出生缺陷方面做了大量卓有成效的工作，結(jié)合血清學篩查、超聲檢查和產(chǎn)前診斷，大大降低了出生缺陷的發(fā)生率。但目前應用最為廣泛的中孕期三聯(lián)血清學產(chǎn)前篩查，它針對特定的沒有任何相應疾病提示的人群（如所有的孕婦人群），通過檢查將其中患某一疾病可能性較大的高危人群篩選出來，以進行其后的診斷性檢查，減少胎兒的丟失率[4]。血清學篩查在三體綜合征的診斷及某些出生缺陷篩查有一定的應用價值。但是中孕期三聯(lián)血清學篩查技術(shù)仍然存在較低的檢出率（70%）和較高的假陽性率（5%）[5]。較低的檢出率導致“漏診”的發(fā)生，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔；而較高的假陽性率增加了不必要的侵入性產(chǎn)前診斷，給受檢孕婦帶來了極大的心理負擔，增加了正常胎兒丟失的風險，大大降低了產(chǎn)前診斷的依從性。

本組研究中553例血清學篩查高風險孕婦經(jīng)無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果異常為12例，羊水穿刺、細胞培養(yǎng)、胎兒染色體核型分析確診染色體異常11例，其中包括21三體綜合征7例、18三體2例，13三體1例，性染色體異常2例。

胎兒無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測是利用大規(guī)模平行測序技術(shù)對母體外周血中的游離DNA進行深度測序，獲取胎兒染色體信息的方法，從而得出染色體數(shù)目異常風險程度的判斷。新一代測序技術(shù)的新型無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測，對孕婦外周血中存在的胎兒游離DNA進行檢測，通過生物信息學統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)胎兒染色體是否存在21、18、13號染色體三體，與血清學篩查相比，其準確性和特異性較高[6]。游離胎兒DNA主要來源于胎盤組織，其在母血體血漿中的含量可能與胎盤屏障功能關(guān)系密切。如果存在胎盤發(fā)育不良、胎盤破損等胎盤屏障功能障礙，可能會導致母體血漿中游離胎兒DNA含量下降而影響檢測結(jié)果[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)12例無創(chuàng)DNA檢測異常孕婦中羊水穿刺染色體正常為1例，11例篩查結(jié)果與羊水穿刺結(jié)果相一致，敏感度為100.00%（11/11），特異度為99.91%（540/541），假陰性率為0（0/552），假陰性率為0.09%（1/552），無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測對21三體，13三體和性染色體的符合率為100.00%，對18三體的符合率為50.00%。相比于血清學篩查，無創(chuàng)DNA篩查更加準確，誤診率低，有效地避免不必要的侵入性產(chǎn)前診斷。

但胎兒無創(chuàng)DNA測序技術(shù)有一定的局限性，主要表現(xiàn)：①對染色體三體疾病中的雙胎，多胎情況，檢測技術(shù)的靈敏度與特異性可能會下降；②孕婦1年內(nèi)接受過異體輸血、移植手術(shù)、異體細胞治療等；③篩查的目標疾病少，僅對21三體，18三體，13三體整倍體異常，不能檢測出胎兒染色體異位、倒位，微缺失等染色體結(jié)構(gòu)異常疾病，且對三體疾病中存在部分嵌合體，檢測存在難度[8]；④孕婦本人為染色體疾患患者或攜帶者；⑤孕期合并惡性腫瘤；如無法檢出可由細胞遺傳學方法檢出的其他染色體結(jié)構(gòu)異常，只對特定染色體檢出率高。篩查高風險結(jié)果還是需要經(jīng)羊水穿刺或絨毛，臍血穿刺給予確認。

我國全國產(chǎn)前診斷技術(shù)專家于2012年就無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)進行了論證。邊旭明等[9]指出，該檢測技術(shù)是一種“近似于診斷水平”、“目標疾病指向精確”的產(chǎn)前篩查，應與現(xiàn)有的產(chǎn)前篩查體系相結(jié)合，準確把握臨床適用人群，包括：①有介入性產(chǎn)前診斷先兆流產(chǎn)、發(fā)熱、有出血傾向、感染未愈等禁忌證者；②產(chǎn)篩高?；蚺R界風險高危孕婦；③珍貴兒，知情后拒絕介入性產(chǎn)前診斷的孕婦；④對介入性產(chǎn)前診斷極度焦慮的孕婦；⑤就診時處于較大孕周，超出目前產(chǎn)前篩查范圍的孕婦。目前無法對其余的染色體進行檢測，且不能分析染色體結(jié)構(gòu)上的異常。相比于血清學篩查，其費用較高，無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)尚未全面普及。如何對它的應用范圍、技術(shù)局限有清晰的認識、如何對患者進行正確的臨床指導，有賴于進一步的研究和經(jīng)驗積累。正確有效的咨詢能夠使患者充分了解各項技術(shù)的利弊并選擇最有利于自身的方案.除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)對于性染色異常的檢出率高達100.00%。

因此，本研究建議首先可通過傳統(tǒng)的血清學篩查從廣大普通孕婦人群中發(fā)現(xiàn)高危者，然后采用無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)對這些高危者進行篩查，對異常者再進一步進行介入性手術(shù)，同時向孕婦充分解釋這些方法的可行性、有效性、局限性和相應結(jié)局的風險，由知情權(quán)衡后個體化選擇。這項技術(shù)有效規(guī)避了流產(chǎn)和感染帶來的風險，并可極大降低孕婦及家屬的心理負擔，代表了當前產(chǎn)前檢測和防止先天性缺陷兒出生的最新發(fā)展方向。隨著二胎政策的開發(fā)，高齡孕婦的增多，對于出生缺陷的防控也是重中之重，雖然無創(chuàng)DNA高風險結(jié)果仍需其他產(chǎn)前診斷技術(shù)進行確診，但它在孕婦產(chǎn)檢過程中減少了孕婦對羊膜腔穿刺技術(shù)的恐懼，而且無創(chuàng)DNA取代血清學篩查是趨勢，對于產(chǎn)前篩查來說無創(chuàng)是一項重要的技術(shù)補充手段，無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)無疑是一個充滿活力的全新的發(fā)展方向。

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[9]邊旭明，蔣宇林，戚慶煒.產(chǎn)前診斷，走中國自已的道路[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2017，47（11）：801-803.

收稿日期：2018-2-2；修回日期：2018-2-15

編輯/李樺