楊建華， 迪麗拜爾·馬木提， 王曉梅， 王 梅， 胡君萍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部； 2藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

藥物的排泄是藥代動力學(xué)研究的主要部分，經(jīng)尿液及糞便排泄是藥物排出體外的主要途徑，能較直觀反映藥物的體內(nèi)代謝過程和排泄特征，其中藥物的腎臟排泄是目前大多數(shù)藥物的最主要排泄途徑[1]。秦皮甲素和秦皮乙素均屬于香豆素類化合物，是毛菊苣(Cichoriumglandulosum)保肝作用的主要有效成分[2-4]。本課題組前期對毛菊苣藥材中秦皮甲素、秦皮乙素等5種主要成分進(jìn)行了含量分析[5]，并研究了兩者在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)[6]以及在大鼠尿液中的代謝產(chǎn)物[7]。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取富集大鼠尿液中的秦皮甲素和秦皮乙素，用HPLC法進(jìn)行分離測定，建立了HLPC法同時測定大鼠尿中秦皮甲素與秦皮乙素的方法，并初步探索了其在大鼠尿中的藥動學(xué)行為，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Shim-pack VP-ODS色譜柱(日本島津島津)，INLUCK T74420型C18固相萃取小柱(北京英萊克科技發(fā)展有限公司)，Microfuge 22R型高速低溫離心機(jī)(貝克曼科技發(fā)展有限公司)，UB-7型pH計(北京丹佛儀器有限公司)，S-114型電子天平(北京丹佛儀器有限公司)，VORTEX-5型漩渦振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，KQ-200 VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HSC-24A型氮吹儀(天津HENGAO科技發(fā)展有限公司)，Milli-Q型超純水系統(tǒng)(上海摩速科學(xué)器材有限公司)。

1.2試藥秦皮甲素對照品(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號09040722)，秦皮乙素對照品(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號09040724)，替硝唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品鑒定所，批號10036-200703)，色譜純甲醇、乙腈(美國Fisher公司)，水為超純水(自制，Milli-Q型超純水系統(tǒng))。

1.3實(shí)驗(yàn)動物6只SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(新)2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制稱取秦皮甲素對照品和秦皮乙素對照品各0.050 g置于25 mL容量瓶，配成秦皮甲素與秦皮乙素濃度為2.0 mg/mL的混合對照品溶液。稱取替硝唑?qū)φ掌愤m量配制濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2色譜條件色譜柱為Shim-pack VP-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.2%甲酸(13∶87)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫為35℃，檢測波長為339 nm。在此色譜條件下秦皮甲素與秦皮乙素色譜峰分離度均大于1.5，拖尾因子分別為0.994 2和1.035 4，理論塔板數(shù)分別為4 973和6 128，均符合含量測定要求。

2.3大鼠尿液樣品的收集SD大鼠6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，收集大鼠0～48 h的空白尿，分別以秦皮甲素(66.6 mg/kg體質(zhì)量)和秦皮乙素(77.4 mg/kg體質(zhì)量)灌胃，收集0～1、1～3、3～6、6～10、10～24、24～36、36～48 h的尿液，-20℃冰箱冷凍儲藏，備用。

2.4大鼠尿樣的處理固相萃取小柱先依次用甲醇3 mL，水3 mL活化[8]，取尿樣500 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，混勻后通過已活化的固相萃取小柱，用1 mL蒸餾水淋洗，繼用甲醇1 mL洗脫，收集洗脫液，于40℃水浴上氮?dú)獯蹈?，殘渣?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，于10 000 r/min離心5 min，取上清液5 μL,進(jìn)樣。

2.5專屬性考察在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，大鼠空白尿樣中無秦皮甲素、秦皮乙素和內(nèi)標(biāo)峰出現(xiàn)，證明大鼠尿樣中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品及內(nèi)標(biāo)的測定,見圖1、2。

圖1 大鼠空白尿液HPLC色譜圖

2.6基質(zhì)效應(yīng)取空白尿液，按“2.4”項(xiàng)下方法先處理后再加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL和內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，配制成0.1、1.0、10.0 μg/mL濃度的3個質(zhì)控(QA)樣品，每個濃度2份，吹干后復(fù)溶進(jìn)樣；同時相應(yīng)濃度的對照品和內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣，記錄峰面積，加入尿樣基質(zhì)的秦皮甲素和秦皮乙素的峰面積(A)與未加尿樣基質(zhì)的峰面積(A0)的比值，即為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明秦皮甲素與秦皮乙素的基質(zhì)效應(yīng)(MS)與內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)效應(yīng)(MS-IFA)在0.8～1.1，均能滿足方法學(xué)要求，見表1。

(注：1.秦皮甲素；2.替硝唑；3.秦皮乙素)

2.7線性關(guān)系與檢出限取混合對照品溶液配制秦皮甲素與秦皮乙素濃度分別為5、25、50、250、500 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取大鼠空白尿樣480 μL共5份，分別加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL、濃度為50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，混勻，使SD大鼠尿液中秦皮甲素與秦皮乙素的濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL。按“2.4”項(xiàng)下方法操作，在前述色譜條件下進(jìn)行測定。分別用秦皮甲素、秦皮乙素的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(F1，F(xiàn)2)對秦皮甲素、秦皮乙素濃度(X1，X2)進(jìn)行直線回歸，求得的回歸方程分別為：F1=0.121 4X1-0.028 3，r=0.998 5(n=5)；F2=0.138 9X2-0.043 1，r=0.999 1(n=5)。結(jié)果秦皮甲素和秦皮乙素尿樣在0.1～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限分別為0.055 7 μg/mL和0.060 0 μg/mL。

表1 秦皮甲素和秦皮乙素在大鼠尿中的基質(zhì)效應(yīng)(n=2)

2.8精密度試驗(yàn)取濃度分別為0.1、1.0、10.0 μg/mL的QA樣品各5份，分別按“2.4”項(xiàng)下方法處理尿樣，24 h內(nèi)重復(fù)測定5次，連續(xù)測定5 d，秦皮甲素的日內(nèi)、日間精密度RSD≤6.63%，秦皮乙素的日內(nèi)、日間精密度RSD≤7.61%，表明方法精密度良好，見表2。

表2 秦皮甲素和秦皮乙素大鼠尿樣日內(nèi)、日間精密度(n=5)

2.9回收率試驗(yàn)取高、中、低濃度的3組QA樣品測定濃度，另取3組相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，未經(jīng)處理直接進(jìn)樣，前后兩個濃度的比值為提取回收率。結(jié)果表明，高、中、低 3個濃度的提取回收率均大于70%，見表3。

2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)取高、中、低濃度的3組QA樣品，于4℃冰箱中放置0、4、12、24 h后取出，置于室溫進(jìn)樣測定。將放置4、12、24 h的樣品與其處理后立即進(jìn)樣的數(shù)據(jù)來進(jìn)行分析比較，觀察其濃度變化。結(jié)果表明秦皮甲素、秦皮乙素尿液樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定，見表4。

表3 秦皮甲素，秦皮乙素在大鼠血漿中的回收率(n=3)

2.11大鼠尿樣中秦皮甲素和秦皮乙素排泄參數(shù)秦皮甲素和秦皮乙素灌胃給予大鼠后不同時間段尿中測得的累積排泄量數(shù)據(jù)，見表5。尿藥排泄數(shù)據(jù)經(jīng)3P87藥代動力學(xué)計算程序采用速度法來計算藥動學(xué)參數(shù)，秦皮甲素體內(nèi)滯留時間為1.280 3 h，ke=0.063 1/h，t1/2=10.983 h；秦皮乙素體內(nèi)滯留時間為3.396 9 h，ke=0.064 0/h，t1/2=10.828 h。兩種藥累積排泄百分率分別為0.578%和0.355%，秦皮乙素48 h累積尿藥排泄量大于秦皮甲素，見圖3。

表4 秦皮甲素和秦皮乙素的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=4)

表5 秦皮甲素和秦皮乙素尿藥累積排泄量

圖3 大鼠尿樣中秦皮甲素和秦皮乙素的累積排泄率

3 討論

萃取法是生物體內(nèi)藥物分析測定前樣品處理應(yīng)用最多的分離、純化方法。萃取法包括液-液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)。SPE原理是采用適當(dāng)填料的小柱經(jīng)合理的洗脫步驟后使得被分析物與雜質(zhì)干擾分離，該方法最大優(yōu)點(diǎn)是處理樣品干凈，若洗脫條件優(yōu)化恰當(dāng)，還具有回收率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)考察了C18與聚酰胺2種不同填料的固相萃取柱，結(jié)果表明C18柱對秦皮甲素、秦皮乙素均有較強(qiáng)的吸附性，處理樣品干凈，無明顯基質(zhì)效應(yīng)，萃取回收率高。實(shí)驗(yàn)還考察樣品最佳上樣量，淋洗液的種類和體積，洗脫液的種類和體積，最后確定固相萃取小柱先依次用甲醇3 mL，3 mL水活化，尿液樣品500 μL，1 mL蒸餾水淋洗，1 mL甲醇洗脫時，樣品過柱、淋洗、洗脫過程中損失的最小，回收率高，沒有雜質(zhì)峰干擾。

口服香豆素在生物體胃腸道中很快被吸收并在體內(nèi)分布，并正常代謝，少許以原形排泄[9-11]。本研究結(jié)果顯示：大鼠口服秦皮甲素、秦皮乙素后，秦皮甲素最大的尿排泄量發(fā)生在0～1 h時間段內(nèi)，而秦皮乙素最大尿排泄量發(fā)生在3～6 h時間段內(nèi)，且秦皮甲素體內(nèi)滯留時間短，累積排泄百分率低；根據(jù)尿藥排泄參數(shù)可知秦皮甲素、秦皮乙素口服后吸收快，迅速達(dá)到峰濃度，體內(nèi)消除快，秦皮甲素、秦皮乙素僅極少部分以原形藥物從腎排泄，絕大部分以代謝產(chǎn)物從體內(nèi)排泄，提示秦皮甲素經(jīng)胃酸進(jìn)行苷鍵水解為秦皮乙素后發(fā)生吸收，主要的代謝產(chǎn)物均為秦皮乙素的還原、水解及二相代謝產(chǎn)物。