馬桂芝， 陳雪珊， 蔣思思， 段 霞

(新疆醫(yī)科大學1藥學院； 2科學技術(shù)處， 烏魯木齊 830011； 3第一附屬醫(yī)院， 烏魯木齊 830054；4新疆維吾爾自治區(qū)第一濟困醫(yī)院藥劑科， 烏魯木齊 830017)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種原因未明且多發(fā)的全身自身免疫性疾病，其基本病理改變是滑膜慢性炎癥及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞，臨床特征為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的炎癥和腫脹、慢性進行性病程，并可致多個關(guān)節(jié)完全強直，最終導(dǎo)致功能的喪失。RA具有發(fā)病率、致殘率高的特點，是嚴重危害人類健康的主要疾病之一[1]。近年來，代謝組學在類風濕性關(guān)節(jié)炎疾病的診斷和小分子生物標記物研究應(yīng)用方面日趨廣泛[2-3]，根據(jù)代謝組學方法和動物疾病模型相結(jié)合的研究思路，重點采用相關(guān)檢測技術(shù)考察類風濕性關(guān)節(jié)炎形成過程中的內(nèi)源性小分子代謝物，有助于尋找可能的類風濕性關(guān)節(jié)炎標志物，詮釋疾病發(fā)病可能的機制[4-5]。本課題組在前期研究中已完成類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備，在此基礎(chǔ)上，本研究建立了柱前衍生高效液相色譜-紫外分光光度(柱前衍生-HPLC-UV)法測定類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠尿樣中16種氨基酸的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器及試藥

1.1儀器LC-20AB高效液相色譜儀(日本島津公司)；XS205電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2試藥色譜甲醇(sigma-Aldrich公司)；色譜乙腈(sigma-Aldrich公司)；異硫氰酸苯酯(PITC)(東京化成工業(yè)株式會社)；天冬氨酸(Asp，上海源葉生物科技有限公司，批號S24A8I34463)、谷氨酸(Glu，上海源葉生物科技有限公司，批號YY91069)、絲氨酸(Ser，上海源葉生物科技有限公司，批號SM0503GC13)、甘氨酸(Gly，上海源葉生物科技有限公司，批號SM0315GA14)、谷氨酰胺(Gln，上海源葉生物科技有限公司，批號YY91070)、?；撬?Tau，上海源葉生物科技有限公司，批號108K1305V)、組氨酸(His，上海源葉生物科技有限公司，批號060M8201V)、丙氨酸(Ala，上海源葉生物科技有限公司，批號S20A6G17672)、精氨酸(Arg，上海源葉生物科技有限公司，批號MKBD3032V)、脯氨酸(Pro，上海源葉生物科技有限公司，批號S30J6G1)、酪氨酸(Tyr，上海源葉生物科技有限公司，批號YY91110)、纈氨酸(Val，上海源葉生物科技有限公司，批號081M00551V)、蛋氨酸(Met，上海源葉生物科技有限公司，批號SLBK1770V)、異亮氨酸(Iso，上海源葉生物科技有限公司，批號SM0503GD13)、亮氨酸(Leu，上海源葉生物科技有限公司，批號S05M8I35309)、犬尿氨酸(Kyn、東京化成工業(yè)株式會社，批號K0016)、苯丙氨酸(Phe Kyn，東京化成工業(yè)株式會社，批號A5513)、色氨酸(Try，上海源葉生物科技有限公司，批號S02D7I26049)、賴氨酸(Lys，上海源葉生物科技有限公司，批號S26A8I34751)、高胱氨酸(Hcy、上海源葉生物科技有限公司，批號YY20109)；其他試劑均為分析純。

1.3實驗動物SPF級Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量(200±2) g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號 SCXK(新)2011-0004。動物飼養(yǎng)室溫度20℃～25℃，濕度(50±10)%。

2 方法與結(jié)果

2.1大鼠關(guān)節(jié)炎模型的制備與尿樣采集取牛Ⅱ型膠原10 mg，加入0.1 mol/L醋酸5 mL充分溶解，配制成2 mg/mL溶液，4℃過夜備用。取弗氏完全佐劑5 mL，加入5 mL 2 mg/mL牛Ⅱ型膠原溶液混合乳化。于右后足趾部皮內(nèi)注射0.1 mL乳化液進行初次免疫后，于第7天相同劑量尾根部加強注射1次。

2.2色譜條件色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(250 mm×4.6 mm×4.6 μm)，流動相A：乙腈-甲醇-水(6 ∶2 ∶2)，混合均勻后用0.45 μm濾膜過濾，流動相B：稱取7.6 g無水乙酸鈉，溶于1 000 mL蒸餾水中，超聲溶解后用冰醋酸調(diào)pH為6.5，混合均勻后用0.45 μm濾膜過濾。 線性梯度洗脫程序：0.01 min，95%B；7 min，94%B；20 min，90%B；30 min，88%B；40 min，75%B；45 min，70%B；55 min，65%B；65 min，48%B；70 min，0%B；75min，50%B；80 min，95%。柱溫35℃，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

2.3氨基酸混合標準溶液配制將19種氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、組氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、犬尿氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸)用0.1 mol/L HCL溶液溶解分別配制成各氨基酸濃度為10 mg/mL的儲備液，4℃冰箱放置備用。

2.4尿樣處理方法尿樣從-80℃冰箱中取出后置于冰袋上溶化，4℃下15 000 r/min 離心15 min，取上清液200 μL至2 mL EP管中，加1 mol/L三乙胺-乙腈溶液100 μL，0.1 mol/L PITC-乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置50 min，加入正己烷400 μL，震蕩后15 000 r/min 離心5 min，取下層溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后按“2.2”項下色譜條件進行測定分析。

2.5色譜系統(tǒng)適用性分別取200 μL 50 μg/mL氨基酸混標溶液、200 μL 0.1 mol/L HCL、200 μL空白尿樣按“2.4”項下方法處理，進樣分析。在此色譜條件下19種氨基酸達到基線分離，分離度良好，峰形對稱，預(yù)處理殘留衍生化試劑與待測氨基酸分離度良好，不干擾氨基酸的定量測定，見圖1-3。

圖1 氨基酸對照品溶液HPLC色譜圖

圖2 空白試劑HPLC色譜圖

圖3 尿樣中氨基酸HPLC色譜圖

注：1天冬氨酸(Asp),2谷氨酸(Glu),3絲氨酸(Ser),4甘氨酸(Gly),5谷氨酰胺(Gln),6組氨酸(His),7?；撬?Tau),8精氨酸(Arg),9丙氨酸(Ala),10脯氨酸(Pro),11酪氨酸(Tyr),12纈氨酸(Val),13蛋氨酸(Met),14異亮氨酸(Iso),15亮氨酸(Leu),16犬尿氨酸(Kyn),17苯丙氨酸(Phe),18色氨酸(Try),19賴氨酸(Lys)

2.6方法學考察

2.6.1 線性范圍和檢測限 精密移取氨基酸混標儲備液，梯度稀釋，按“2.4” 項下方法處理，采用“2.2”項下色譜條件進行分析，以各氨基酸峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸，以信噪比(S/N)=3對應(yīng)各氨基酸的濃度為檢測限。13種氨基酸在其相應(yīng)的線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好(0.995 9～0.999 7)，見表1。

表1 氨基酸對照品線性范圍及檢測限結(jié)果(n=5)

2.6.2 精密度及準確度實驗 取已知各氨基酸濃度的空白尿樣樣品，加入高、中、低3個濃度的混標溶液(n=5)，按“2.4”項下方法處理，按“2.2”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積，計算各氨基酸濃度、相對標準偏差及回收率。結(jié)果 13種氨基酸在線性范圍內(nèi)回收率良好，回收率在85%～115%，準確度良好，RSD均小于15%，見表2。

表2 回收率和精密度試驗結(jié)果(%， n=5)

2.6.3 穩(wěn)定性實驗

2.6.3.1 樣品溶液15 h內(nèi)的穩(wěn)定性 取空白尿樣，按“2.4”項下方法處理后的樣品溶液于0、2、4、6、9、12、15 h進樣分析，記錄氨基酸峰面積，計算各氨基酸濃度及相對標準偏差。結(jié)果13種氨基酸在15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD均小于15%，見表3。

2.6.3.2 尿樣在30 d內(nèi)的穩(wěn)定性 將空白尿樣存放-80℃冰箱，于第0天，第10天和第30天取樣，按“2.4”項下方法處理，采用“2.2”項下色譜條件進行分析，記錄氨基酸峰面積，計算各氨基酸濃度及相對標準偏差。結(jié)果表明13種氨基酸在40 d內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD均小于15%，見表4。

表3 大鼠尿樣中氨基酸15 h穩(wěn)定性結(jié)果(μg/mL)

表4 大鼠尿樣中氨基酸30 d內(nèi)穩(wěn)定性結(jié)果

2.7大鼠尿中氨基酸的含量測定分別取大鼠造模前后的尿液，4℃低溫5 000 r/min離心 15 min，取上清液，按“2.4”項下方法處理，采用“2.2”項下色譜條件測定，記錄氨基酸峰面積，計算各氨基酸濃度，見表5。

3 討論

3.1衍生方法的選擇氨基酸的衍生方法有鄰苯二甲醛(OPA)法、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯(AQC)法、2，4-二硝基氟苯(DNFB)法、異硫氰酸苯酯(PITC)法等[6-9]，其中6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯(AQC)法和2，4-二硝基氟苯(DNFB)法適用于熒光檢測器檢測，鄰苯二甲醛(OPA)法雖在紫外和熒光檢測器下均可檢測到，但其衍生產(chǎn)物具有不穩(wěn)定性(某些氨基酸信號衰減較快)，異硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法是常用的氨基酸衍生法，方法重現(xiàn)性好，衍生產(chǎn)物較穩(wěn)定，靈敏度高，因此被廣泛應(yīng)用與氨基酸樣品的測定當中，因此本試驗確定采用異硫氰酸苯酯(PITC)法進行樣品中氨基酸的衍生。

表5 尿樣中各氨基酸濃度

3.2液相色譜條件的摸索本試驗考察了COSMOSIL Cholester色譜柱、5C18-MS-II色譜柱對尿樣中氨基酸分離的效果，COSMOSIL Cholester膽固醇基色譜柱是固定相鍵合了膽固醇基的反相色譜柱，對疏水化合物有較強的立體選擇性，在與ODS相同的分析條件下分離效果與重現(xiàn)性均更好，可帶來更好的可重現(xiàn)的分析結(jié)果。最終選用COSMOSIL 5C18-MS-II色譜柱作為尿樣中氨基酸分析的的色譜柱。