姜 蕓， 吳 莉

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院綜合內(nèi)二科, 烏魯木齊 830011)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由肺內(nèi)或肺外原因引起的急性肺間質(zhì)性炎和肺泡-毛細(xì)血管膜損傷，最終造成血氧過低、肺動脈高壓及肺內(nèi)微血栓的形成并導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸衰竭[1]，近年來越來越多的研究表明炎癥細(xì)胞的過度活化和促炎-抗炎介質(zhì)的穩(wěn)態(tài)失衡是ARDS發(fā)病的主要機制[2-3]。脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)可通過刺激單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量炎癥因子引發(fā)機體炎性損傷[4]，其中Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)是介導(dǎo)LPS應(yīng)答的主要受體之一，細(xì)胞膜受體識別并結(jié)合LPS后分別激活下游NF-κB和JNK/SAPK激活下游TLR4信號通路造成相關(guān)信號分子的異常表達(dá)[5-6]。另一方面，肺內(nèi)炎癥細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子,形成瀑布效應(yīng),進(jìn)一步加劇肺內(nèi)和全身的炎性反應(yīng)，深入研究多種炎癥因子及抗炎因子在炎性反應(yīng)中的變化規(guī)律有助于發(fā)現(xiàn)藥物治療的新靶點。TLR4信號抑制劑TAK242能特異性阻斷TLR4細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域TIR Toll/IL-1受體,而TAK242在LPS誘導(dǎo)ARDS小鼠相關(guān)炎性介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)中尚未見報道，本研究通過注射LPS模擬膿毒血癥致小鼠ARDS的發(fā)病過程，初步探究TAK242對體內(nèi)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)表達(dá)變化的影響，為臨床靶向治療ARDS提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料無特定病原體(specific pathogens free, SPF)級6～8周齡成年雄性BALB/c小鼠45只，均購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)及實驗取材過程中嚴(yán)格遵守實驗動物倫理保護等相關(guān)規(guī)定；LPS(Sigma)；TAK242(Med Chem Express)；TLR4(ab22048)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(ab6671)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)(ab100712)抗體均購自Abcam公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(AB-2305)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒均購西安英杰生物科技有限公司；TRIzol(Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(TAKARA)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自英杰生物科技有限公司，檢測引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2建立LPS誘導(dǎo)小鼠ARDS模型及評估

1.2.1 ARDS模型建立 取45只小鼠隨機分為3組，每組15只，分別為未行尾靜脈注射的對照組，尾靜脈注射5 μg/g LPS的ARDS組，尾靜脈給予與ARDS組等體積無菌生理鹽水的假手術(shù)組，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膿毒血癥，分組依據(jù)及建模方法參照文獻(xiàn)的方法。建模后行動脈血氣分析，檢測動脈血氧分壓(PaO2)及吸入氧濃度(FiO2)，以PaO2/FiO2<300 mmHg為建模成功[7]。

1.2.2 肺組織HE染色評估ARDS模型 造模完成后，立即在等同的時間點取3組小鼠左側(cè)肺組織置于4%多聚甲醛溶液(4℃，pH7.4)中固定6～8 h后以石蠟包埋，冠狀面切片(5 μm)，經(jīng)HE染色后在顯微鏡下觀察肺部形態(tài)，參照美國胸科協(xié)會(American thoracic society, ATS)對急性肺損傷的評定系統(tǒng)[8]，分別從肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集、肺泡增厚或透明膜形成等4個方面檢測肺組織損傷情況，通過小鼠生存狀態(tài)及病理切片等指標(biāo)評估ARDS模型建立的有效性。

1.2.3 TAK242對ARDS模型小鼠的影響 基于LPS誘導(dǎo)雄性BALB/c小鼠ARDS模型，取45只小鼠隨機分為3組，每組15只，分別為尾靜脈給予5 μg/g LPS的ARDS組，尾靜脈給予5 ng/g TAK242+5 μg/g LPS的TAK242+ARDS組以及尾靜脈給予等體積無菌生理鹽水的空白對照組。造模成功立即同時分別取各組小鼠肺、肺泡灌洗液進(jìn)行下一步實驗檢測。

1.3酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量沿小鼠腹部前正中線打開胸腔并結(jié)扎右肺門，以外徑2 mm頭皮針剪去部分作為氣管導(dǎo)管插入暴露的左主支氣管內(nèi)，緩慢推注約2 mL常溫生理鹽水對小鼠肺部灌洗3次，每次以回收液體體積>1 mL為灌洗回收標(biāo)準(zhǔn)，收集的肺泡灌洗液4℃ 4 000 r/min低速離心10 min，取上清采用TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒檢測含量，ELISA檢測操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4Real-timePCR檢測相關(guān)mRNA表達(dá)取各組小鼠右肺上葉組織剪碎，加入液氮充分研磨后加入TRIzol，參照TRIzol試劑說明書提取肺組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，參照熒光實時定量PCR試劑盒說明書定量檢測TLR4、TNF-α、IL-6相關(guān)mRNA表達(dá)變化。設(shè)置反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min，隨后按95℃變性1 min,55℃退火2 min,72℃延伸1 min的程序設(shè)置40次循環(huán)，循環(huán)完成后設(shè)置95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s做溶解曲線。每個樣品均配3個副孔，實驗重復(fù)3次，同時做陰性對照組排除PCR污染及引物二聚體干擾。以采集到的熒光信號值(Ct值)，計算2-△△Ct值分析相關(guān)mRNA在各組細(xì)胞中表達(dá)水平的變化。

1.5Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)取各組小鼠肺組織50 mg,加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，置于冰上采用組織勻漿器充分勻漿，裂解20 min，4℃12 000 r/min離心15 min，收集上清。經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量檢測蛋白含量后各取50 μg蛋白1：1加入1×SDS上樣緩沖液煮沸變性蛋白。行10%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將上述蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，抗體孵育后至凝膠成像儀顯色曝光，檢測目的蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1LPS誘導(dǎo)ARDS模型有效性造模過程中，對照組及假手術(shù)組小鼠精神狀態(tài)正常，呼吸平穩(wěn)，無異?；顒颖憩F(xiàn)；ARDS組小鼠精神狀態(tài)紊亂，出現(xiàn)呼吸急促，活躍程度減弱等病癥現(xiàn)象。解剖過程中肉眼可見模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯腫脹，顏色暗紅。HE染色切片觀察如圖1，ARDS組小鼠較正常對照組小鼠和假手術(shù)組小鼠肺組織炎癥反應(yīng)明顯，肺泡及肺泡隔的結(jié)締組織內(nèi)均可見大量炎性細(xì)胞浸潤。ARDS組肺組織病理現(xiàn)象符合ARDS動物模型標(biāo)準(zhǔn)，證明模型建立有效。

對照組

假手術(shù)組

ARDS組

圖1HE染色觀察LPS誘導(dǎo)小鼠ARDS模型肺組織病理表現(xiàn)

2.2TAK242抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠ARDS疾病模型給予TAK242誘導(dǎo)后小鼠肺組織中細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生明顯變化，ARDS組小鼠肺組織中TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組(P<0.05)，給予TAK242治療后相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量相應(yīng)減少(圖2、3)。給予TAK242組別的小鼠較ARDS組小鼠TNF-α、IL-6含量明顯降低(P<0.05)(表2)。HE染色顯示TAK242有效地緩解了LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥反應(yīng)，肺泡及肺泡隔的結(jié)締組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤減少，ARDS小鼠肺組織病理狀態(tài)出現(xiàn)退行性改善，見圖4。

3 討論

ARDS是世界性的公共衛(wèi)生難題，截至2015年， 其死亡率已高達(dá)55%，目前的治療手段常包括機械通氣治療與非機械通氣治療兩大類[9-10]，仍缺乏特效治療措施。 近年來的研究顯示炎癥反應(yīng)在ARDS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)、集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)等促發(fā)瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)，炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)構(gòu)成了ARDS炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”[11-13]。除了有效的抗感染外，精確的調(diào)控平衡ARDS發(fā)病過程中的炎性介質(zhì)，下調(diào)過度炎癥反應(yīng)，減少炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)對肺組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的破壞，維持呼吸系統(tǒng)功能在ARDS的治療中顯得尤為重要。其中TLR4信號通路是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎性通路之一，其特異性拮抗劑與LPS誘導(dǎo)ARDS小鼠模型相關(guān)炎性介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)未見報道，故開展上述研究。

表2 3組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05； 與ARDS組比較，#P<0.05。

圖2 RT-PCR檢測肺組織中相關(guān)mRNAs表達(dá)變化

注: 與對照組比較，*P<0.05；與ARDS組比較，△P<0.05。

圖3 WB檢測肺組織中相關(guān)蛋白表達(dá)變化

對照組

ARDS組

TAK242+ARDS組

圖4HE染色觀察TAK242對LPS誘導(dǎo)ARDS小鼠肺組織病理狀態(tài)的改變

本研究首先通過LPS誘導(dǎo)構(gòu)建ARDS小鼠模型，通過小鼠生存活動狀態(tài)、動脈氣血分析、肺組織形態(tài)及HE染色等方法驗證建模有效性。通過給予ARDS小鼠TLR4抑制劑TAK242進(jìn)一步驗證TLR4信號通路與下游炎性介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)在ARDS小鼠中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，給予TAK242后小鼠肺組織中TLR4 mRNA及蛋白水平較模型組明顯減少，同時TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)隨之降低(P<0.05)。同時，通過ELISA檢測小鼠肺灌洗液中TNF-α、IL-6的含量，本研究發(fā)現(xiàn)給予TAK242后小鼠肺灌洗液中TNF-α、IL-6等炎癥因子含量較ARDS組明顯降低(P<0.05)，該結(jié)果提示，TAK242可能通過特異性阻斷胞內(nèi)TIR受體阻斷TLR4受體下游信號傳導(dǎo)，繼而影響LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的激活。其作用機理主要是由于作為首要的模式受體家族成員之一，TAK242對TLR4抑制主要通過減少由其介導(dǎo)的含Toll白介素1受體域銜接蛋白(TIRAP)、粘附分子(ICAM-1)及TRAM的表達(dá)，抑制下游轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TAK1)的激活，進(jìn)而抑制p38、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)等重要轉(zhuǎn)錄因子的激活[14-15]，削弱體內(nèi)炎癥反應(yīng)進(jìn)程，最終達(dá)到對LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠病理狀態(tài)的改變。另一方面，TLR4、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子表達(dá)的減少，肺泡和肺泡隔的結(jié)締組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤也會隨之減弱，在一定程度上對LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠病理狀態(tài)改變起到促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TAK242對治療LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠具有一定的積極作用，這種作用可能通過靶向TLR4下調(diào)TNF-α、IL-6等炎癥因子實現(xiàn)，TAK242可能作為有效的抑制劑在ARDS發(fā)揮重要作用。但與此同時，生物體內(nèi)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)是一個復(fù)雜多樣生物學(xué)過程，仍需要從整體、器官、細(xì)胞、分子多多水平多層次進(jìn)行考慮,綜合分析多種動態(tài)易感因素的影響,最終達(dá)到對ARDS早期干預(yù)和治療的目的。