趙 靜， 胡 泊， 王 鵬， 王致輝， 朱玥潔， 鞏曉蕓

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心， 烏魯木齊 830054)

隨著體外受精-胚胎移植(IVF-ET)實驗室培養(yǎng)體系和培養(yǎng)環(huán)境的不斷改進和不斷完善，讓胚胎在體外環(huán)境進一步發(fā)育到囊胚階段進行移植已經(jīng)成為眾多生殖中心的常規(guī)應用策略[1]。延長胚胎在體外培養(yǎng)的目的是形成比卵裂期胚胎有更好發(fā)育潛能的胚胎，剔除卵裂期形態(tài)正常而染色體異常的胚胎，最終達到提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率的目的[2]。但是在臨床工作中關于囊胚的選擇方面還存在諸多問題。 由于胚胎發(fā)育速度不完全同步，第5日(D5)和第6日(D6)都能形成囊胚，究竟什么時期什么階段的囊胚更具有發(fā)育潛能，一直以來是囊胚選擇的爭論點[3]。因此，本研究通過回顧性分析本中心407例行冷凍囊胚復蘇移植患者的臨床資料，比較移植D5和D6囊胚的主要臨床指標，旨在選擇最合適的囊胚冷凍時機，為臨床工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象回顧性分析2015年1月-2016年12月年在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心進行凍融囊胚移植的407個周期613個囊胚，年齡28～42歲，不孕年限2～8年，其中男方因素不孕83例(男性少弱精癥或無精癥，20.4%)，女方因素不孕274例(輸卵管盆腔因素、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位癥等，67.2%)，不明原因不孕50例(12.4%)。根據(jù)冷凍囊胚的時間，將研究對象分為D5組(221個周期384個囊胚)和D6組(186個周期229個囊胚)，所有研究的囊胚均經(jīng)患者同意并簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1 囊胚的分期和質(zhì)量標準 參照Gardner等提出的的囊胚分期和分級標準[4]： 1期囊胚為早期囊胚，囊胚腔體積小于囊胚總體積的1/2；2 期囊胚為囊胚腔體積大于或等于囊胚總體積的1/2； 3期囊胚為完全擴張囊胚,囊胚腔占據(jù)整個囊胚；4期囊胚為完全擴張囊胚,囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴大,透明帶變?。?5期囊胚為正在從透明帶孵出的囊胚； 6 期囊胚為完全從透明帶孵出的囊胚。內(nèi)細胞團(innercell mass，ICM)： A級：形態(tài)規(guī)則，直徑在60 μm以上，細胞大小均勻，融合；B級：形態(tài)不規(guī)則，直徑在60 μm以上，細胞大小不勻，有相當一部分沒有融合；C級：明顯小于正常大小，細胞數(shù)極少。滋養(yǎng)外層(trophectoderm， TE)： A級：沿囊胚“赤道面”分布的細胞數(shù)明顯超過10個，大小均勻，在囊胚底面的細胞全部形態(tài)清晰，大多數(shù)可見細胞核；B級：沿囊胚“赤道面”分布的細胞數(shù)10個左右，大小欠均勻，在囊胚底面的部分細胞形態(tài)清晰，部分可見細胞核；C級：沿囊胚“赤道面”分布的細胞數(shù)明顯少于10個，大小明顯不均勻，滋養(yǎng)細胞與透明帶之間有明顯的碎片殘留，囊胚底面的細胞難以辨認。本中心的囊胚移植和冷凍標準： D5 和D6天3期及3期以上分期囊胚； 囊胚質(zhì)量 ICM和TE分級均為B及以上； ICM和TE有一項分級為C者廢棄。

1.2.2 囊胚冷凍前處理選擇 D5和 D6 囊胚移入30 mL CSC(美國，Irvine Scientific 公司)+10%SSS(美國，Irvine Scientific 公司)的培養(yǎng)液滴內(nèi) ，采用激光皺縮方法進行人工皺縮，在激光鏡頭下，避開囊胚ICM，在透明帶與滋養(yǎng)外胚層交界處給予單個2.0 ms的脈沖打孔，然后待細胞團皺縮后冷凍 。

1.2.3 囊胚冷凍 本中心選擇商品化囊胚冷凍液Vitrification Freeze Kit 90133DSO (美國，Irvine Scientific 公司)進行玻璃化冷凍。冷凍方法參照劑說明書。將皺縮的囊胚放入50 μL的ES平衡液8～10 min，用吸管反復吹吸囊胚幾次，使其更好平衡，然后移入50 μL VS冷凍液，90 s之內(nèi)將囊胚裝載于Cryotop載體上 ，迅速投入液氮內(nèi)保存。

1.2.4 囊胚復蘇及復蘇后處理 本中心選擇商品化囊胚復蘇液Irvine Scientific Vitrification Thaw Kit 90137-SO(美國，Irvine Scientific 公司)進行復蘇。復蘇方法參照劑說明書。解凍時將 Cryotop 取出后直接浸入預熱好的37 ℃解凍液(TS)中1 min， 然后將胚胎依次挪入室溫平衡好的稀釋液(DS)4 min和洗滌液(WS)中8 min。復蘇好的囊胚行激光輔助孵化。選擇在遠離TE且ICM細胞間隙的透明帶位置打孔，衡量孔徑大小的標準以內(nèi)細胞團宜孵出為準。操作完畢后將囊胚移入培養(yǎng)液，置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，待移植前在高倍顯微鏡下統(tǒng)計存活率。

1.2.5 內(nèi)膜的準備 自然周期：適用于月經(jīng)周期正常、有自發(fā)排卵者。月經(jīng)周期第8天至第10天起行陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育。當優(yōu)勢卵泡直徑>1.4 cm時，每日B超監(jiān)測一次，并根據(jù)情況檢測尿黃體生成素(Luteinizing Hormone, LH)、雌二醇(Estrogen, E2)、孕酮(progestin，P)。若B超監(jiān)測已排卵，第5日(D5)為解凍日。人工周期：適用于月經(jīng)不規(guī)律或自然周期監(jiān)測無自發(fā)排卵的患者， 從月經(jīng)第3日起口服戊酸雌二醇，用藥劑量和天數(shù)根據(jù)內(nèi)膜情況調(diào)整。陰道B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度達到7～8 mm 以上時，E2達到150～200 pg/mL以上，給予黃體酮20 mg肌注，第5日(D5)為解凍日。

2 結果

2.12組患者基礎臨床資料比較2組患者在年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、周期方案和不孕類型方面比較，均未見明顯差異(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 2組患者基礎臨床資料比較

2.22組周期特征比較2組患者的基礎內(nèi)分泌水平和轉化日子宮內(nèi)膜厚度、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植囊胚個數(shù)以及囊胚復蘇率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 2組周期特征比較

2.32組妊娠結局的比較D6組的臨床妊娠率顯著高于D5組(P<0.05)，胚胎種植率也顯著高于D5組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。2組早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率和異位妊娠率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 2組患者妊娠結局的比較/例(%)

3 討論

選擇具有發(fā)育潛能的胚胎進行移植，是體外受精-胚胎移植技術成功的一個關鍵因素。但是目前在胚胎篩選方面還存在很大的局限性。隨著培養(yǎng)體系和培養(yǎng)環(huán)境的改善，延長胚胎培養(yǎng)時長至囊胚階段，能夠篩選出發(fā)育潛能好的胚胎，同時囊胚時期胚胎移植與生理情況更加吻合，因此囊胚培養(yǎng)、囊胚冷凍和囊胚移植技術的臨床常規(guī)應用前景廣闊。凍融囊胚移植的優(yōu)勢在于：第一，囊胚移植能夠淘汰在胚子基因組激活之后由于基因或代謝缺陷影響胚胎發(fā)育的胚胎，有報道顯示進行冷凍的卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎有59%具有染色體或基因組學的異常，而冷凍的優(yōu)質(zhì)囊胚僅有35%有染色體或基因組學異常[5]；第二，冷凍囊胚的復蘇率高。因為囊胚的滋養(yǎng)細胞層細胞數(shù)量多而且修復能力強，少數(shù)細胞死亡后對胚胎發(fā)育能力影響小，凍融囊胚可以減少患者凍融胚胎的損失率。囊胚形成時間有第5天、第6天，甚至第7天，選擇何時何種質(zhì)量的囊胚，一直以來沒有定論。有學者認為，D5和D6囊胚的臨床妊娠率和種植率沒有明顯的統(tǒng)計學差異[6-7]。國內(nèi)王雪等[8]的研究結果發(fā)現(xiàn)D5囊胚的種植率和活產(chǎn)率高于D6，但差異無統(tǒng)計學差異。而另一些學者的研究發(fā)現(xiàn)D5囊胚移植的臨床妊娠率和植入率均高于D6囊胚移植[9-11]。

在本研究中，結果顯示解凍復蘇周期中囊胚的發(fā)育天數(shù)對妊娠結局有影響，D6囊胚移植者的種植率和臨床妊娠率均高于D5 囊胚移植者，而兩組患者基礎臨床資料、基礎內(nèi)分泌、流產(chǎn)率、多胎妊娠率和異位妊娠率等情況均無統(tǒng)計學差異，與文獻[12-14]研究結果不一致。分析原因可能有以下三點 ：一是無論D5還是D6囊胚，本中心一律準備第五天的內(nèi)膜進行移植，第五天的內(nèi)膜具有更好的容受性，這點與文獻報道不同；二是本中心對可利用囊胚質(zhì)量的要求嚴格，無論TCM還是TE，有C級出現(xiàn)均不予利用，保證D5與D6總體囊胚的質(zhì)量上沒有差異；三是本研究通過分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，D6囊胚均為4期及以上的囊胚，而D5囊胚有18%(69/384)為3期囊胚。有研究表明，預測臨床妊娠率和活產(chǎn)率一個重要的因子是囊胚的擴張狀態(tài)[15]。4期及4期以上的囊胚擴張狀態(tài)更好，可能更具備發(fā)育潛能，而且和D5的子宮內(nèi)膜有更好的容受性。

綜上所述，本中心凍融囊胚移植周期D6的囊胚臨床妊娠率優(yōu)于D5囊胚，其發(fā)生機制仍需要進一步的探索。在臨床工作的現(xiàn)階段，如何合理地細化囊胚冷凍選擇的標準，并且更大程度提高胚胎的可利用率，是輔助生殖技術領域今后重點研究方向。