任潤健 方磊 賈傳龍 趙虎 陳亮 秦登科 周慧敏 畢波

[摘要]目的：探討PDGF-BB對紫外線誘導(dǎo)的光老化成纖維細(xì)胞中ROS的影響及抑制氧化應(yīng)激的作用特點。方法：利用CCK-8法檢查不同濃度PDGF-BB對成纖維細(xì)胞增殖活性的影響，篩選治療最佳濃度；PDGF-BB預(yù)處理成纖維細(xì)胞48h后，利用UVB體外重復(fù)照射構(gòu)建成纖維細(xì)胞光老化模型；利用β-半乳糖苷酶染色法檢測細(xì)胞衰老程度；裝載活性氧（ROS）檢測探針，利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞技術(shù)觀察和檢測各組ROS的表達(dá)。結(jié)果：PDGF-BB預(yù)處理輻照組（UVB+PDGF-BB組）中β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞的著色比率低于UVB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在UVB誘導(dǎo)的應(yīng)激性老化中，UVB組ROS表達(dá)顯著高于正常組（P<0.05）；PDGF-BB預(yù)處理輻照組（UVB+PDGF-BB組）ROS表達(dá)顯著低于UVB組（P<0.05）。結(jié)論：PDGF-BB可降低UVB介導(dǎo)的光老化成纖維細(xì)胞中ROS的表達(dá)，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，可在一定程度上緩解光老化進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞]光老化；PDGF-BB；成纖維細(xì)胞；ROS；UVB

[中圖分類號]R758.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）05-0109-03

Effect of PDGF-BB on Reactive Oxygen Species in UVB-induced Skin Fibroblasts

REN Run-jian1，F(xiàn)ANG Lei1，JIA Chuan-long2，ZHAO Hu1，CHEN Liang2，QIN Deng-ke2，ZHOU Hui-min1，BI Bo1

（1.Department of Clinical Laboratory Medicine；2.Department of Plastic and Aesthetic Surgery，Huadong Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 200040，China）

Abstract： Objective To explore the effect of PDGF-BB on reactive oxygen species （ROS） in UVB-induced skin fibroblasts and the characteristics of oxidative stress. Methods The effect of PDGF-BB of different dosages on the activity of fibroblasts was detected by CCK-8 assay. After pretreatment of fibroblast 48h with PDGF-BB， the photoaging model was successfully established with UVB in vitro. The senescence degree of cells was detected by the β-galactosidase staining method. ROS test probe was loaded and oxidative stress of fibroblasts was induced by UVB irradiation in vitro and the expression of ROS was measured by fluorescence microscopy and flow cell technology respectively. Results The coloring percentage of the cells stained by beta galactosidase in the PDGF-BB pretreatment group（UVB+PDGF-BB group） was lower than that in the UVB group， the difference was statistically significant（P<0.05）. In UVB induced stress aging， the expression of ROS in UVB group was significantly higher than that in normal group（P<0.05）. The expression of ROS in the PDGF-BB pretreatment group （UVB+PDGF-BB group） was significantly lower than that of UVB group（P<0.05）. Conclusion PDGF-BB can reduce ROS expression in fibroblasts induced by UVB irradiation and decrease oxidative stress， and it could alleviate photoaging in some extent.

Key words： photoaging； platelet derived growth factor BB（PDGF-BB）； fibroblasts； reactive oxygen species（ROS）； ultraviolet radiation B（UVB）

皮膚光老化作為皮膚老化的重要組成部分，嚴(yán)重影響人們的外觀和身體健康[1-2]。在其發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，紫外線，尤其是波長范圍290～320nm的中波紫外線（Ultraviolet radiation B， UVB）成為主要誘因[3]。UVB引起的皮膚光老化主要表現(xiàn)為彈性缺失，皺紋加深，色素沉著，甚至誘發(fā)黑色素瘤等[4]。在這一復(fù)雜病理生理過程中，成纖維細(xì)胞（Fibroblasts， FBs）受到損傷，出現(xiàn)一系列衰老表型，如細(xì)胞肥大鋪展，β-半乳糖苷酶染色陽性，細(xì)胞周期阻滯等。有研究認(rèn)為UVB誘導(dǎo)活性氧（Reactive oxygen species， ROS）的異常生成，光子能量轉(zhuǎn)化為化學(xué)能量所造成的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致光老化的主要機制。血小板衍生因子（Platelet derived growth factor， PDGF）是由兩條多肽鏈組成的二聚體，相對分子質(zhì)量為28～35KD，主要由成熟的血小板分泌，存在于多種組織中如血小板、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞，是一種促有絲分裂刺激源[5]。同時，PDGF有很強的趨化作用，對骨骼肌細(xì)胞、未分化間充質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞等都有很強的趨化功能。近來有研究發(fā)現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，PDGF-BB可抑制自由基活性氧（ROS）產(chǎn)生，保護(hù)線粒體超微結(jié)構(gòu)對抗氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮其保護(hù)作用[6]。然而，PDGF-BB能否改善UVB造成的氧化應(yīng)激，從而延緩光老化進(jìn)程尚不清楚。本研究應(yīng)用此前在體外建立的成纖維細(xì)胞光老化模型（Stress-induced premature senescence， SIPS），予以外源性PDGF-BB處理，觀察其對SIPS-FBs的生物學(xué)作用。

1 材料和方法

1.1 小鼠皮膚細(xì)胞的獲取：取1～3d新生SPF級C57 BL/6小鼠，乙醚麻醉后浸泡于75%乙醇中8～10min，用滅菌PBS洗去殘留乙醇，無菌條件下分離其背部皮膚，留取1cm×1cm皮膚組織，立即置于2%中性蛋白酶中，密封，4℃冰箱過夜；將皮膚取出后分離表皮與真皮，剪碎真皮，置于0.1%膠原酶中，37℃恒溫?fù)u床消化2h，待組織團塊基本消失可離心，1 500r/min離心5min，收集沉淀；棄去上清，用DMEM+10% FBS制成細(xì)胞懸液，吹打均勻后以約2×105/cm2密度接種于培養(yǎng)皿置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待2～3d后，細(xì)胞近80%～90%融合時進(jìn)行傳代，比例約為1：4。

1.2 藥物預(yù)處理及光老化模型的建立：選用P1代細(xì)胞，首先利用含不同PDGF-BB濃度DMEM+10% FBS處理約48h。本研究中，成纖維細(xì)胞隨機分為4組：正常組（無PDGF-BB預(yù)處理，無UVB輻照），PDGF-BB組（PDGF-BB預(yù)處理，無UVB輻照），UVB組（無PDGF-BB預(yù)處理，UVB輻照），UVB+PDGF-BB組（PDGF-BB預(yù)處理，UVB輻照）。隨后依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)方法[7]，棄去培養(yǎng)液，覆蓋薄層PBS緩沖液，置于UVB燈管（Philips TL 20W/01RS lamp）正下方，打開蓋子，進(jìn)行輻照，照射劑量為120mJ/cm2。輻照完畢后，除去PBS，加入5ml DMEM+1% FBS繼續(xù)培養(yǎng)，間隔12h照射1次，120s/次，共4次；末次輻照完成后改用DMEM+10% FBS繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 β-半乳糖苷酶染色：將生長于6孔板中的成纖維細(xì)胞吸除培養(yǎng)基，用PBS洗滌后加入1ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫下固定15min。吸掉固定液，用滅菌PBS洗滌3次，加1ml工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配），利用鹽酸及氫氧化鈉調(diào)整pH至6[8]。37℃孵育過夜。普通光學(xué)顯微鏡下觀察到胞質(zhì)呈藍(lán)色者為陽性細(xì)胞，表示細(xì)胞處于衰老狀態(tài)。陽性率的計算方法為200倍下隨機取10個視野，計算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.4 檢測細(xì)胞ROS生成：按照DCFH2-DA：DMEM-free serum配比1：1 000制備試劑，加入6孔板中1ml/孔，置于培養(yǎng)箱中37℃孵育20～30min。吸掉培養(yǎng)液，無血清DMEM洗滌3次后，薄層PBS覆蓋細(xì)胞，置于UVB燈管下，照射1次，劑量為120mJ/cm2，2min后棄去PBS，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，30min后置于熒光顯微鏡下觀察，同樣的藥物處理及輻照后即刻用0.25%胰酶消化細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測ROS表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 13.0分析結(jié)果，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDGF-BB實驗濃度的篩選：使用梯度PDGF-BB濃度的DMEM+10% FBS處理小鼠成纖維細(xì)胞，0～8ng/ml PDGF-BB對成纖維細(xì)胞活性無影響，且有不同程度促進(jìn)作用，尤以1ng/ml顯著。因此，本次選擇1ng/ml的PDGF-BB作為后續(xù)細(xì)胞處理的藥物濃度（見圖1）。

2.2 β-半乳糖苷酶染色結(jié)果：正常組和PDGF-BB組細(xì)胞鮮有染色；UVB組衰老染色主要集中在細(xì)胞核周，呈藍(lán)綠色；經(jīng)過PDGF-BB預(yù)處理的輻照組（UVB+PDGF-BB組）中陽性染色的細(xì)胞顯著減少（見圖2），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 細(xì)胞ROS生成檢測結(jié)果：UVB可導(dǎo)致ROS一過性升高，峰值出現(xiàn)在照射后30min左右。共聚焦熒光顯微鏡下觀察可見，經(jīng)UVB組細(xì)胞的熒光強度強于正常組；與UVB組相比，經(jīng)過PDGF-BB預(yù)處理的輻照組（UVB+PDGF-BB組）中熒光強度明顯下降（見圖3）。流式細(xì)胞儀檢測分析顯示，與UVB組相比，經(jīng)過PDGF-BB預(yù)處理的輻照組（UVB+PDGF-BB組）中的相對熒光強度的波峰向左回移，ROS水平明顯下降（見圖4）。

3 討論

活性氧（ROS）是生物體內(nèi)的氧通過單電子還原產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)活潑物質(zhì)，包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子自由基（O2·-）、和羥基自由基（·OH）等[9]。低濃度的ROS有助于細(xì)胞生理活動的調(diào)節(jié)，而過量的ROS可氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子，激活炎性信號通路甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或變性壞死[3]。ROS半衰期很短，可與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白-蛋白交聯(lián)、蛋白-DNA交聯(lián)和脂質(zhì)過氧化等，與癌癥、衰老、心血管疾病等疾病密切相關(guān)[10]。因此，抑制ROS過表達(dá)，維持氧化/還原平衡成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項重要課題[11]。

在成纖維細(xì)胞光老化模型中，經(jīng)UVB反復(fù)照射，成纖維細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，即反復(fù)ROS過量產(chǎn)生，大量消耗細(xì)胞內(nèi)還原物質(zhì)，最終形成累積性的氧化損傷。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)90%的ROS由線粒體產(chǎn)生，而線粒體本身又極易受到氧化攻擊，發(fā)生線粒體DNA（mtDNA）突變、膜電位下降、膜完整性缺失等，從而形成了惡性循環(huán)，加重氧化應(yīng)激，加速衰老[12]；ROS的聚集亦可誘導(dǎo)DNA氧化破壞與交聯(lián)，引起復(fù)制錯誤，破壞核苷酸輔酶以及滅活含巰基酶，繼而引發(fā)轉(zhuǎn)錄水平的改變[13]；ROS過表達(dá)不利于細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix， ECM）穩(wěn)態(tài)的維持，ROS可激活多種信號通路，抑制酪氨酸磷酸酶，激活多個受體，導(dǎo)致下游的分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases， MAPK）、p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）等活化[14]，使得核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子AP-1 （Activator protein 1， AP-1）的表達(dá)增多，抑制I型膠原前體表達(dá)，加強基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases， MMPs）表達(dá)，造成ECM相關(guān)蛋白分泌減少，破環(huán)ECM穩(wěn)態(tài)。而ECM對皮膚膚質(zhì)好壞具有決定性作用[15]。

PDGF-BB是PDGF家族中活性最強的亞型，可與所有的受體分子（α-受體，β-受體）相結(jié)合，與跨膜酪氨酸激酶受體結(jié)合后可誘導(dǎo)許多其他細(xì)胞內(nèi)蛋白的酪氨酸磷酸化，介導(dǎo)成纖維細(xì)胞趨化、增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶，參與創(chuàng)傷修復(fù)、肌腱重塑、潰瘍愈合等[16]。PDGF-BB可誘導(dǎo)特異性的生物反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、遷移、基質(zhì)合成、血管生成和生長因子的釋放。其在皮膚愈合，慢性潰瘍，肌腱修復(fù)，骨折及創(chuàng)傷中的研究和應(yīng)用逐漸加深和普及。近年來，有研究表明，PDGF-BB具有線粒體保護(hù)作用。ROS產(chǎn)生與清除失衡后，線粒體膜電位下降，線粒體DNA突變，電子鏈傳遞和正常氧化磷酸化受到干擾，ATP生成減少，細(xì)胞走向衰老和凋亡。有研究證實PDGF-BB可通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （Phosphatidylinositol 3 kinase /protein kinase B，PI3K/AKt）信號保護(hù)線粒體超微結(jié)構(gòu)，緩解氧化應(yīng)激。另外PDGF-BB可誘導(dǎo)抗氧化物酶如過氧化氫酶（Catalase，CAT），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase2，SOD2），谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase 1，GPX1）的產(chǎn)生，有助于清除ROS，恢復(fù)細(xì)胞氧化/還原平衡[6]。本研究探討PDGF-BB可否減少UVB誘導(dǎo)的FBs內(nèi)ROS過表達(dá)。實驗結(jié)果表明，1ng/ml PDGF-BB可有效減少ROS含量，提示其對UVB導(dǎo)致的氧化應(yīng)激有的一定的拮抗作用。

綜上所述，本實驗證實了PDGF-BB可減少衰老染色陽性細(xì)胞，降低光老化成纖維細(xì)胞中ROS過表達(dá)，減輕UVB誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激從而緩解UVB對成纖維細(xì)胞的損傷。提示PDGF-BB可在一定程度上減緩光老化進(jìn)程。然而，其對ROS表達(dá)抑制的具體機制及對成纖維細(xì)胞其他方面的影響，包括細(xì)胞周期、胞外基質(zhì)平衡等需進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2018-03-12 [修回日期]2018-04-17

編輯/朱婉蓉