孟紅旭， 姚明江， 任鈞國， 劉建勛

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所， 中藥藥理北京市重點實驗室， 北京， 100091)

在使用膜片鉗技術(shù)記錄心肌細胞鈣通道的實驗中，鈣通道電流會發(fā)生隨時間經(jīng)過的衰減現(xiàn)象，被稱為“rundown”現(xiàn)象。實驗中，如在細胞內(nèi)液中加入ATP、鈣螯合劑EGTA以及低濃度的Mg2+能部分減少“rundown”現(xiàn)象[1], 穿孔膜片鉗技術(shù)幾乎完全解決了記錄通道電流時發(fā)生“rundown”的現(xiàn)象。但是，由于電極內(nèi)液中的其他大分子無法與胞內(nèi)物質(zhì)進行交換，從而限制了穿孔膜片鉗技術(shù)的應用[2,3]。由于鈣通道對Ba2+具有通透性，Ba2+常常作為鈣通道的載流離子應用于鈣通道電流的記錄中，如采用Ba2+替代細胞外Ca2+記錄L型鈣通道電流，雖然可產(chǎn)生一定的增幅效應，但也會造成通道失活特性的明顯改變，對觀察藥物的鈣通道作用產(chǎn)生一定影響[4]。在記錄L型鈣通道電流時，于細胞外加入一定濃度的Ba2+是否對L型鈣通道的失活特性和電流衰減產(chǎn)生影響尚不清楚。為此，本研究觀察了細胞外Ba2+對記錄大鼠心肌細胞L-型鈣通道的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠，體重(180±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證：SCXK(京2007-0001)。

1.2 藥物及配制液體

丹酚酸A(純度>95%)由北京本草天源藥物研究院提供。其他藥品除特別注明外，皆購自美國Alfa Aesar。無鈣臺式液(mmol/L)：NaCl 140, KCl 5.4, NaH2PO40.33, MgCl21, Glucose 10, Hepes 10 (用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4)。KB液：KOH 70, KCl 40, KH2PO420, Glutamic acid 50, MgCl23, Taurine 20, EGTA 0.5, Hepes 10, Glucose 10 (用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.4)。記錄鈣通道細胞外液(mmol/L): 臺式液(無鈣臺式液+CaCl21.8)；記錄鈣通道電極內(nèi)液(mmol/L)：CsCl 140, MgCl22, CaCl21, EGTA 11, MgATP 5, Hepes 10 (用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7.2)。

1.3 心室肌細胞的分離

腹腔注射10%烏拉坦麻醉SD大鼠，迅速開胸取出心臟，在零度無鈣臺式液中剝離出主動脈，懸掛于Langendorff心臟灌流裝置上，確保管口不超過主動脈的心臟入口，棉線固定，行主動脈逆行灌流，流量為7～8 ml/min。先用無鈣臺氏液灌流5 min，接著用含酶低鈣臺氏液[0.4 mg/ml膠原酶Ⅱ(Worthington)+0.03 mg/ml蛋白酶ⅩⅣ(Sigma)+0.9 mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)+CaCl20.05 mmol/L]灌流19～24 min，最后用低鈣臺式液(CaCl20.4 mmol/L)灌流5 min，剪取心室組織置KB液中剪碎，吹打，用100目篩網(wǎng)過濾，最后將細胞保存于KB液中，4 ℃低溫可保存36 h。整個操作過程中，維持灌流液溫度在(37±1)℃，灌流液中充純氧氣至飽和[5,6]。

1.4 膜片鉗技術(shù)

使用電極拉制儀(PULL-100，美國)拉制電極，在玻璃電極中充電極內(nèi)液后使阻抗達到2～4 MΩ。吸幾滴細胞懸液加入細胞池中，細胞貼壁后選擇桿狀、表面光滑、紋理清晰的心肌細胞，利用三維操縱器移動電極貼近目標細胞并輕壓在細胞表面，稍加負壓即可形成1 GΩ 水平以上的高阻抗封接，再用較大負壓吸破細胞膜，形成全細胞記錄形式。由刺激采集軟件Pulse控制實驗過程，使用膜片鉗放大器(EPC10，德國)通過模數(shù)轉(zhuǎn)換采集數(shù)據(jù)，存放于計算機硬盤。將細胞鉗制在-40 mV使鈉通道和T型鈣通道失活， 用CsCl代替電極內(nèi)液中的KCl，阻斷K+電流外流。給予從-40 mV至0 mV持續(xù)250 ms的除極電壓，可以得到迅速活化、緩慢失活的內(nèi)向電流，該電流可被鹽酸地爾硫卓(10 μmol/L)阻斷，確定為L型鈣通道電流。給予上述除極電壓，以0.3 Hz的頻率連續(xù)記錄15 min，L型鈣電流峰值幅度為電流活化峰值與穩(wěn)定失活后電流幅度之差。

1.5 實驗設計

實驗以Ba2+(1.8 mmol/L)完全替換臺式液中的Ca2+(1.8 mmol/L)，觀察L型鈣通道電流失活特征變化；直接向臺式液中加入Ba2+(0～8 mmol/L)，觀察電流失活特征變化和峰值電流15 min內(nèi)的變化。每個數(shù)據(jù)采用5個以上細胞進行重復檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 細胞外不同濃度Ba2+對L-型鈣通道電流的影響

通過灌流裝置使Ba2+逐漸替代細胞外液中的Ca2+，連續(xù)記錄L-型鈣通道電流(ICa,L)軌跡。通道電流的失活速率逐漸減慢，在Ba2+全部替換Ca2+后，電流峰值及失活變化速率保持穩(wěn)定(圖1A)。失活速率變化適合采用單指數(shù)方程描述，失活速率時間常數(shù)由替換前的(88.6±5.3) ms (n=5) 變化至(246.4±26.6) ms (n=6) (P<0.01)。將Ba2+(0.2，0.4，0.8 mmol/L)加入至細胞外液中，通道電流的失活速率略變慢(圖1B)，其中0.2 mmol/L Ba2+和0.4 mmol/L Ba2+的時間常數(shù)分別為(89.4±6.3) ms (n=5)和(93.6±7.6) ms (n=6)，與未加入Ba2+([Ba2+]=0)細胞組的時間常數(shù)無明顯差異(P>0.05)；加入0.8 mmol/L Ba2+，電流失活速率時間常數(shù)為(96.1±6.6) ms (n=6)，與未加入Ba2+([Ba2+]=0)細胞組電流失活速率時間常數(shù)差異顯著(P<0.05)。

2.2 細胞外 Ba2+濃度對不同時程的L-型鈣通道電流峰值電流的影響

與細胞外未加Ba2+([Ba2+]=0)的細胞組比較，細胞外分別加入0.2，0.4 mmol/L Ba2+的兩組細胞的L-型鈣通道電流峰值隨時程變化衰減程度明顯減弱。圖2顯示3個細胞分別在細胞外液0 mmol/L Ba2+、0.2 mmol/L Ba2+、0.4 mmol/L Ba2+的條件下，鈣通道電流峰值隨時間變化的衰減狀況。在3種實驗條件下的前5 min左右，通道電流峰值均呈現(xiàn)加速衰減的過程，此后的衰減緩慢。我們比較了三種實驗條件下5 min、10 min、15 min 3個時間點通道電流峰值的衰減率(表1)，細胞外液中加入Ba2+(0.2，0.4 mmol/L)的兩組細胞，在10 min和15 min 2個時間點L-型鈣通道電流峰值電流的衰減明顯減弱，雖然兩組之間無統(tǒng)計學差異，但是0.4 mmol/L Ba2+組減緩電流峰值隨時間衰減的變化趨勢更明顯。

Fig.1Effects of extracellular Ba2+on inactivation rate of ICa,L

A： Ba2+instead of Ca2+gradually in extracellular solution; B： Ba2+(0.2, 0.4, 0.8 mmol/L) added in the extracellular solution

Fig.2Effect of extracellular Ba2+concentration (0, 0.2, 0.4 mmol/L) on the peak current rate at different time points

ConditionsBa2+(mmol/L)nRecording time (min)510150614.1±8.427.7±7.336.6±7.70.255.5±4.615.0±13.2*19.5±13.4*0.457.6±5.612.5±10.3*13.9±8.5**

*P<0.05，**P<0.01vsBa2+0 group

2.3 細胞外Ba2+濃度對電流電壓曲線的影響

在細胞外液Ba2+濃度為0、0.4 mmol/L的條件下，成功破膜后等待5 min至電流衰減的平臺期，鉗制電位設為-40 mV，給予時長250 ms，階躍為10 mv, 從-40至+70 mV的系列去極化脈沖，可得到一組電流軌跡(圖3A)。以刺激電壓和與電壓對應的電流峰值繪制電流電壓曲線(圖3B)。從曲線中可以看出，當Ba2+濃度為0.4 mmol/L時電流電壓曲線下移，峰值電流密度增大[由9.86±2.77 pA/pF (n=6)增至12.97±1.38 pA/pF(n=5)]，翻轉(zhuǎn)電位增大(由50 mV增至70 mV)，而不改變峰值電壓和I-V曲線的形狀。

Fig.3Effect of extracellular Ba2+concentration on current-voltage relationship of ICa,L

A: Currents recorded from holding voltage -40 mV to test potential; B: Current-voltage curve from the peak current of ICa,L

2.4 細胞外 Ba2+濃度對記錄丹酚酸A抑制L-型鈣通道作用的影響

最近本實驗室報道，丹參的一種有效成分-丹酚酸A(salvianolic acid A，Sal A)具有濃度依賴性的抑制大鼠心室肌細胞L-型鈣通道電流的作用[7]。我們觀察了在細胞外液Ba2+濃度為0和0.4 mmol/L兩種條件下，100 μmol/L Sal A的抑制效應(圖4A)。在0.4 mmol/L Ba2+的條件下，檢測6個細胞Ba2+細胞外液條件下，100 μmol/L Sal A對鈣通道的抑制強度明顯弱于細胞外液0 mmol/L Ba2+條件下(檢測8個細胞)的抑制效應(抑制率分別為37.8%±8.4%和53.4%±3%，P<0.01)，而且藥物洗脫后下峰值電流回復較0 mmol/L Ba2+條件下更徹底。在兩種細胞外液下條件，Sal A都顯示了濃度依賴性的抑制L-型鈣通道電流(0 mmol/L Ba2+條件下，檢測10個細胞；0.4 mmol/L Ba2+條件下，檢測12個細胞)，其量效曲線均適合以logistic公式進行擬合(圖4B)。在0.4 mmol/L Ba2+細胞外液條件下，量效曲線右移，統(tǒng)計后顯示在兩種細胞外液(0，0.4mmol/L)條件下，Sal A的IC50分別為和38 μmol/L和55 μmol/L。

3 討論

采用膜片鉗技術(shù)記錄離子通道電流時出現(xiàn)的“rundown”現(xiàn)象，對細胞藥理學研究產(chǎn)生了很大影響。一些方法在抑制“rundown”現(xiàn)象方面已經(jīng)取得了明顯效果，特別是1988年Horn等建立的穿孔膜片鉗技術(shù)(perforated patch clamp technique)。這種膜片鉗技術(shù)通過向細胞內(nèi)液中加入制霉菌素(nystatin)或兩性霉素(amphotericin)等抗生素，在細胞膜上穿孔形成特定孔道，選擇性地允許一些離子和大分子物質(zhì)進出，既保持了電極內(nèi)與細胞內(nèi)液之間電學的連續(xù)性，又避免對胞內(nèi)重要物質(zhì)的滲析產(chǎn)生影響，使細胞內(nèi)環(huán)境保持相對穩(wěn)定，幾乎完全避免了記錄通道電流時發(fā)生“rundown”現(xiàn)象。但是，由于穿孔膜片鉗形成后，電極內(nèi)液向胞內(nèi)的滲析作用幾乎喪失，某些通過電極內(nèi)液向細胞內(nèi)加入活性物質(zhì)的研究無法進行，而且實驗中常出現(xiàn)特定孔道“再封口”和自發(fā)性轉(zhuǎn)變?yōu)閭鹘y(tǒng)的全細胞模式等現(xiàn)象[8,9]。因此，仍然需要進一步探索解決“rundown”現(xiàn)象的方法。

Fig.4Effect of extracellular Ba2+concentration on ICa,Linhibition induced by Salvianolic acid A

A： Current peak weakened by Sal A (100 μmol/L) in extracellular 0.4 mmol/L Ba2+； B： Concentration-response curve from the current peak in extracellular 0.4 mmol/L Ba2+

由于鈣通道對Ba2+具有通透性，因此Ba2+常常作為鈣通道的載流離子應用于鈣通道電流的記錄中。本實驗首先觀察了以Ba2+替代臺式液中的Ca2+，觀察其對大鼠心肌細胞L型鈣通道電流的影響。結(jié)果顯示，L型鈣通道峰值電流的幅度未見明顯增大，通道電流的失活隨著Ca2+逐漸被替換而逐漸減緩，完全替換后失活速率時間常數(shù)增加約2倍，這個現(xiàn)象證實鈣通道失活具有明顯的Ca2+依賴性。若在細胞外液中加入低濃度的Ba2+(0.2，0.4 mmol/L)，對鈣通道失活速率的影響不明顯，但是將Ba2+濃度提高至0.8 mmol/L時，失活速率常數(shù)差異顯著，表明低濃度的Ba2+對鈣通道失活特性的影響較小。此后，連續(xù)觀察了低濃度Ba2+對鈣通道電流峰值衰減的影響。結(jié)果顯示，無論是否加入Ba2+，鈣通道電流峰值均在5 min呈現(xiàn)較快的衰減，在5～12 min出現(xiàn)衰減平臺，之后再次出現(xiàn)較快的衰減，與未加入Ba2+時比較，加入Ba2+后電流衰減程度明顯降低，其中10 min和15 min時間點衰減差異明顯，提示在細胞外液中加入適當?shù)腂a2+可以減弱“rundown”現(xiàn)象。

“rundown”現(xiàn)象的形成機制目前仍有爭議，但是認為鈣依賴性的蛋白水解和PKA介導的磷酸化的逆轉(zhuǎn)是“rundown”形成的主要原因，而且一些未知的細胞內(nèi)因子也參與了這個過程中鈣通道的調(diào)控[10,11]。目前已知，Ca2+依賴性的Ca2+/CaM復合體不僅能使L型鈣通道失活，而且直接減慢鈣通道從失活狀態(tài)的恢復。鈣通道的這種失活作用主要源于Ca2+/CaM復合體結(jié)合到L型鈣通道α亞單位羧基端IQ基序，這種結(jié)合與鈣通道周圍Ca2+的飽和性有關[12]。因此認為，加入鈣通道的載流離子Ba2+后記錄到的鈣電流應為Ca2+和Ba2+的混合電流，這樣可使鈣通道周圍Ca2+延遲達到飽和，這可能是細胞外Ba2+減弱“rundown”現(xiàn)象的原因。在細胞外Ba2+對鈣通道電壓依賴性的影響實驗中，作者發(fā)現(xiàn)在細胞外液中加入Ba2+可下移電流電壓曲線，改變翻轉(zhuǎn)電位，但是不改變峰值電壓和I-V曲線的形狀，這種改變可能系由于“rundown”現(xiàn)象減弱，使鈣通道在不同電壓刺激下一直能夠保持較高的電流密度所致。作者觀察了在細胞外液中加入Ba2+的條件下，藥物藥理作用的變化。一種已知具有鈣抑制作用的中藥單體化合物丹酚酸A，在使用正常臺式液和含Ba2+臺式液過程中，藥物的抑制效應出現(xiàn)明顯差異，這可能是由于Ba2+有效地減少了電流衰減，能更加準確地反映藥物的量效關系。

綜上所述，本研究顯示在細胞外液中加入一定濃度的Ba2+，可使采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄L-型鈣通道時出現(xiàn)的“rundown”現(xiàn)象減弱，并減少觀察藥物效應時因出現(xiàn)“rundown”現(xiàn)象引起的實驗誤差。