李先偉， 蔣莉莉， 左東澤， 郝 偉， 吳海龍

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心， 蕪湖 241002；安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 蕪湖 241000)

肺纖維化是多種肺部疾病的最終轉(zhuǎn)歸，其發(fā)病率高，預(yù)后差，且缺乏有效治療方法[1]。因此，探究肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，尋找積極、有效、安全的治療方法，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。近年來，肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(alveolar epithelial-mesenchymal transition, EMT)在肺纖維化中的作用逐漸獲得認(rèn)可[2]。大量研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在EMT過程中起著重要作用，被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的“開關(guān)”，可以誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，同時也是誘導(dǎo)EMT的主要細(xì)胞因子[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以激活Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，二者通過協(xié)同作用影響EMT進(jìn)程，參與肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展，但具體的機(jī)制不明[4]。

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是由37個氨基酸殘基組成的感覺神經(jīng)肽，包括α和β兩種亞型[5]。文獻(xiàn)表明，在內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶-1基因敲除小鼠中，CGRP通過cAMP信號通路抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[6]。最新文獻(xiàn)報(bào)道，eIF3a參與了TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡EMT[7]，但具體的機(jī)制不明。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP通過抑制eIF3a的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[8,9]。而CGRP是否通過影響TGF-β1激活的Notch信號通路、進(jìn)而抑制eIF3a的表達(dá)從而抑制肺泡EMT的進(jìn)程，未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬在培養(yǎng)的肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞上，觀察CGRP抑制肺泡EMT的作用及機(jī)制，旨在為肺纖維化發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，并為尋找抗肺纖維化藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞(RLE-6TN細(xì)胞)購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購于美國Hyclone公司。TGF-β1購于美國RD公司。噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、CGRP、CGRP8-37購于美國 Sigma公司。Masson染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司?？筃otch1、α-SMA、E-cadherin 及collagen Ⅲ抗體均購于英國Abcam公司；抗eIF3a、GAPDH抗體分別購于美國Cell Signaling和Santa Cruz公司。LunimataTM Crescendo發(fā)光液購于美國Millipore公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RR037Q)和熒光定量PCR試劑盒(貨號：RR430A)及引物設(shè)計(jì)合成均購于北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RLE-6TN培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將RLE-6TN細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞生長至70%～80%密度時，用0.25%胰蛋白酶液消化，按1∶3傳代。根據(jù)文獻(xiàn)及前期的研究基礎(chǔ)[5,8]，實(shí)驗(yàn)設(shè)Control組、TGF-β1(5 ng/ml)、CGRP (1、10、100 nmol/L)組、CGRP8-37 (1 μmol/L)+CGRP 100 (nmol/L)組。每組設(shè)9個復(fù)孔。Control組細(xì)胞用滅菌雙蒸水處理48 h，其余各組細(xì)胞分別用CGRP和(或)CGRP8-37預(yù)處理1 h，再用TGF-β1處理48 h。

1.2.2 MTT 法測定細(xì)胞活性 計(jì)數(shù)細(xì)胞后接種于96 孔板(5 000 cells/well)，每組設(shè)6個復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入相應(yīng)藥物處理48 h后，每孔加入MTT 15 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清后，加入DMSO 150 μl, 避光溶解10 min，用Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度 (A490nm)值。根據(jù)公式[(對照組A490nm值-實(shí)驗(yàn)組A490nm值) /對照組A490nm值]×100%，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測eIF3a、Notch1 、E-cadherin、α-SMA和collagen Ⅲ mRNA的水平 用Trizol、氯仿、異丙醇等試劑提取細(xì)胞總RNA后，測定RNA濃度后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照熒光定量PCR試劑盒說明書，用2 μl cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參照，PCR擴(kuò)增基因片段。PCR 反應(yīng)條件參照我們前期研究方法[8,9]。用7 500 System SDS Software分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)ΔΔCt 值，計(jì)算RQ值以比較各組mRNA的表達(dá)。引物如下(表1)。

Tab. 1 Sequences of primers for qPCR

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測eIF3a、Notch1、E-cadherin、α-SMA和collagen Ⅲ蛋白表達(dá) 低溫下提取蛋白質(zhì)，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度。每組取50 μg蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)變性后于12%SDS-PAGE分離樣品，然后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%BSA封閉1 h，分別滴加抗Notch1、eIF3a、α-SMA、E-cadherin 及collagen Ⅲ一抗，以GAPDH為內(nèi)參，4℃過夜。洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)二抗37℃孵育1 h。洗膜3次后加入發(fā)光液，Bio-Rad ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照用，Image J 1.43圖像分析軟件分析條帶的灰度值，以目的條帶的灰度值與內(nèi)參的灰度值比值的表示蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平，分析并比較各組蛋白質(zhì)表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 CGRP對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞活力抑制作用及collagen III mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

與control組相比，TGF-β1處理組細(xì)胞活力明顯減低、而collagen III mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與TGF-β1處理組相比，不同劑量CGRP組細(xì)胞活力明顯升高、而collagen III mRNA和蛋白表達(dá)水平均不同程度降低(P<0.05，P<0.01)，但CGRP的這些作用均可被其抑制劑CGRP8-37所取消(P<0.01，表2，圖1)。

2.2 CGRP對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞α-SMA和E-cadherin表達(dá)的影響

與control組相比，TGF-β1處理組肺泡上皮細(xì)胞E-cadherin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯降低，而α-SMA mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與TGF-β1處理組相比，不同劑量CGRP組E-cadherin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯升高而α-SMA mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯減低(P<0.05或P<0.01)，但CGRP的這些作用均可被其抑制劑CGRP8-37所消除(表3，圖2，圖3)。這些結(jié)果提示，CGRP對肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化具有一定的抑制作用。

2.3 CGRP對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞Notch1和eIF3a表達(dá)的影響

與control組相比，TGF-β1組Notch1、eIF3a mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與TGF-β1組相比，不同劑量CGRP組Notch1、eIF3a mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均不同程度降低(P<0.05，P<0.01)，但CGRP的這些作用均可被其抑制劑CGRP8-37所消除(表4，圖4、圖5)。

3 討論

肺纖維化(PF)的發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，放射性因素、粉塵以及藥物(如百草枯和博萊霉素等)毒副作用等是PF的主要誘發(fā)因素[10]。其典型特征是肺組織內(nèi)大量肌成纖維細(xì)胞聚集，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積并伴有炎細(xì)胞浸潤和損傷。肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts, MFb)的過量增殖是造成ECM聚集的主要原因[11]。PF的本質(zhì)是肺組織修復(fù)過程紊亂所致，其基本過程為：誘發(fā)因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞間的緊密連接消失，表型蛋白(如上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)和緊密連接蛋白-1)表達(dá)降低，而波形蛋白、纖維連接蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)升高，且肌動蛋白重構(gòu)，肺泡原有基底膜破壞，進(jìn)而導(dǎo)致肺泡上皮出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，最終導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)遷移、侵襲等肌成纖維細(xì)胞(MFb)具有的生物學(xué)功能和形態(tài)學(xué)特征[12]。與成纖維細(xì)胞顯著不同的是，MFb具有合成和分泌、收縮以及產(chǎn)生多種細(xì)胞因子的特點(diǎn)[13]。此外，MFb還可以增加ECM的合成，導(dǎo)致其在肺間質(zhì)過度沉積，從而形成PF。由此可見，探討PF發(fā)生發(fā)展過程中EMT發(fā)生的分子機(jī)制，并以此為抑制靶點(diǎn)，抑制MFb的聚集，有望緩解或逆轉(zhuǎn)PF的發(fā)生發(fā)展，從而改善PF患者的肺功能，提高其生存質(zhì)量。

Tab. 2 Effects of CGRP on cell vitality and the expression of collagen III in cultured RLE-6TN cells treated by TGF-β1 n=9)

CGRP: Calcitonin gene-related peptide; CGRP8-37: CGRP receptor inhibitor

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1 group;△△P<0.01vsCGRP (100 nmol/L) group

Tab. 3 Effects of CGRP on the expressions of α-SMA and E-cadherin induced by TGF-β1 in cultured RLE-6TN n=9)

CGRP: Calcitonin gene-related peptide; CGRP8-37: CGRP receptor inhibitor; TGF-β1: Transforming growth factor-β1

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1 group;△△P<0.01vsCGRP (100 nmol/L) group

Fig.1Effects of CGRP on the expression of collagen III induced by TGF-β1 in cultured RLE-6TN cells

Fig.2Effects of CGRP on the expression of α-SMA induced by TGF-β1 in cultured RLE-6TN cells

Tab. 4 Effects of CGRP on the expressions of Notch1 and eIF3a induced by TGF-β1 in cultured RLE-6TN cells n=9)

CGRP: Calcitonin gene-related peptide; CGRP8-37: CGRP receptor inhibitor

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1 group;△△P<0.01vsCGRP (100 nmol/L)group

Fig.3Effects of CGRP on the expression of E-cadherin induced by TGF-β1 in cultured RLE-6TN cells

Fig.4Effects of CGRP on the expression of Notch1 induced by TGF-β1 in cultured RLE-6TN cells

Fig.5Effects of CGRP on the expression of eIF3a induced by TGF-β1 in cultured RLE-6TN cells

CGRP是一種生物活性多肽，由37個氨基酸殘基組成，是辣椒素敏感感覺神經(jīng)的主要遞質(zhì)，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)及心血管及肺血管床內(nèi)[14]。最新的文獻(xiàn)表明，在內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶-1基因敲除小鼠中，CGRP通過cAMP信號通路抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型中，肺組織CGRP的表達(dá)水平明顯降低，而用辣椒素(capsaicin)耗竭內(nèi)源性CGRR后能夠明顯加重博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[8,9]。而CGRP是否參與了肺纖維化肺泡EMT的進(jìn)程，未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，外源性CGRP能夠明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá)、顯著抑制E-cadherin下調(diào)。這些結(jié)果表明，CGRR參與了肺泡EMT進(jìn)程，外源性CGRP能夠抑制肺泡EMT，進(jìn)而減輕肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

eIF3為真核細(xì)胞翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor, eIF) 家族成員，由13 個亞單位組成。eIF3a是eIF3中最大的亞基，分子量為170 kDa[15]。最新的文獻(xiàn)報(bào)道，eIF3a參與了TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡EMT[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，eIF3a參與了肺纖維化成纖維細(xì)胞的增殖活化，而CGRP通過抑制eIF3a的表達(dá)而抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制肺纖維化[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以激活Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，是肺纖維化的關(guān)鍵信號通路之一[3,16]。當(dāng)使用Notch抑制劑DAPT后，可以阻止肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，降低了Notch1和α-SMA mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而抑制肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展[4]。本研究發(fā)現(xiàn)外源性CGRP能夠明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞Notch1和eIF3a的表達(dá)。

綜上所述，TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡EMT可能是肺纖維化發(fā)病的機(jī)制之一。大量研究表明，阻斷TGF-β1信號傳導(dǎo)通路可起到抑制或治療肺纖維化的作用，而我們發(fā)現(xiàn)CGRP對TGF-β1誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化同樣具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與其抑制Notch1、eIF3a表達(dá)有關(guān)。本研究為肺纖維化發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)、為尋找新型抗纖維化藥物提供了新的思路。