王 琦

（長(zhǎng)治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長(zhǎng)治 046011）

1 引言

蛋白質(zhì)是食物的重要營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育具有不可替代的作用。大米中所含蛋白因賴氨酸、蘇氨酸等幾種必需氨基酸的含量比其它禾谷類高[1]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而，當(dāng)前以乳制品和糧食為代表的食品原料存在著較為嚴(yán)重的摻假現(xiàn)象，近年來(lái)陸續(xù)報(bào)道在糧食和乳制品中非法添加三聚氰胺等非蛋白含氮物質(zhì)[2-4]。為降低生產(chǎn)成本，部分企業(yè)和商家向大米產(chǎn)品中添加非蛋白含氮物質(zhì)以冒充高蛋白產(chǎn)品，干擾了市場(chǎng)秩序，對(duì)人體健康形成危害。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的測(cè)定蛋白含量的方法是凱氏定氮法，其原理是通過檢測(cè)食品中氮的總含量來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)含量，而非直接測(cè)量。此方法的弊端是在測(cè)定含有非蛋白氮的樣品時(shí)，結(jié)果會(huì)受到不同程度的干擾，從而使得蛋白質(zhì)的表觀含量有所偏高[5]。針對(duì)該問題，建立一種不受非蛋白氮等其他因素干擾、能夠較準(zhǔn)確地測(cè)定樣品中蛋白的方法來(lái)做為凱氏定氮法的補(bǔ)充就顯得勢(shì)在必行。

之前有學(xué)者采用考馬斯亮藍(lán)法（簡(jiǎn)稱CBB法）測(cè)定了牛奶中蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，三聚氰胺、尿素和毛發(fā)水解物均不會(huì)對(duì)牛奶中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果造成干擾[6-9]。文章將以此為基礎(chǔ)，針對(duì)不同干擾物對(duì)三種大米蛋白含量測(cè)定方法的影響進(jìn)行探究，旨在找到一種不受非蛋白含氮物干擾的測(cè)定來(lái)做為凱氏定氮法的補(bǔ)充，為相關(guān)食品檢驗(yàn)提供一份有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 材料與試劑

大米粉、結(jié)晶牛血清白蛋白（BSA）、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、甲基紅、考馬斯亮藍(lán)試劑（CBB試劑）、福林-酚試劑（Lowry試劑）。

2.1.2 儀器與設(shè)備

725S可見分光光度計(jì)、DK-S24型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋、BCD-290W型電子天平、K9840型全自動(dòng)凱氏定氮儀、SH220型石墨消解儀。

2.2 方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別利用考馬斯亮藍(lán)G-250法（Bradford法）和福林-酚試劑法（Lowry法）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

2.2.2 大米中蛋白質(zhì)提取的正交實(shí)驗(yàn)

文章采用堿消化法，依據(jù)下表所取NaOH濃度、溫度及時(shí)間，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交篩選實(shí)驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系Table 1 Orthogonal experiment reaction system

圖1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)圖

表2 考馬斯亮藍(lán)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析Table2 Coomassie brilliant blue of orthogonal experiment,the results and extreme difference analysis

2.2.3 大米中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法比較

將大米粉以篩選的最佳消化條件進(jìn)行處理，分別以CBB法和Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并與凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果作比較。

2.2.4 添加干擾物實(shí)驗(yàn)比較

大米粉中添加無(wú)機(jī)非蛋白氮化合物對(duì)CBB法、Lowry法測(cè)定的影響，進(jìn)一步確定方法的準(zhǔn)確性和精確度。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1、2結(jié)果可以看出，測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程良好（R2>0.99），滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)

3.2.1 極差分析

表3 Lowry正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析

表2 考馬斯亮藍(lán)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析Table 3 Lowry orthogonal experiment results,and extreme difference analysis

由表2、3可以看出，影響考馬斯亮藍(lán)法的主次因素是A（NaOH濃度）；B（溫度）；C（時(shí)間），其最優(yōu)條件是：A3B2C1，即：0.1 mol/L NaOH，35℃，60 min；而影響Lowry法的主次因素是A（NaOH濃度）；B（溫度）；C（時(shí)間），其最優(yōu)條件是：A3B2C1，即：0.1 mol/L NaOH，35℃，60 min。

3.2.2 方差分析

通過對(duì)表2，3的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，分別繪制出兩種方法的方差分析表，見表4、5。

表4 考馬斯亮藍(lán)方差分析表Table 4 Coomassie brilliant blue difference analysis table

表5 Lowry方差分析表Table 5 Lowry anova table

據(jù)表4、5可以得出，因素A高度顯著，因素B顯著，因素C不顯著。因素主次順序A-B-C，與極差分析基本吻合。對(duì)因素A、B分析，確定優(yōu)水平為A3、B2；因素C的水平改變對(duì)試驗(yàn)結(jié)果幾乎無(wú)影響，可從經(jīng)濟(jì)、操作等角度考慮取值，選C1。最優(yōu)水平組合為 A3B2C1。即：0.1 mol/L NaOH，35℃，60 min；結(jié)合極差分析和方差分析可得采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的最優(yōu)蛋白含量為7.14%，采用Lowry法測(cè)得的最優(yōu)蛋白含量為9.26%，二者分別與凱氏定氮法測(cè)得的含氮量8.7%相比，可知Lowry法準(zhǔn)確度更高。

3.3 三種測(cè)定方法的比較

由表6可以看出，CBB法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的結(jié)果較凱氏定氮法明顯偏低，從78.22%到80.33%不等?？捡R斯亮藍(lán)主要與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸結(jié)合，而不同種類的蛋白質(zhì)中以上兩類氨基酸的含量和比例差別較大。Lowry法的測(cè)定結(jié)果與凱氏定氮法相比則表現(xiàn)出基本接近的趨勢(shì)，這是因?yàn)樵贚owry法的顯色反應(yīng)中起作用的有兩方面的因素：一是蛋白質(zhì)肽鏈中的肽鍵與堿性銅溶液中的Cu2+結(jié)合在堿性條件下可以形成絡(luò)合物；二是絡(luò)合物將酚試劑還原生成鉬藍(lán)-鎢藍(lán)藍(lán)色化合物，兩步反應(yīng)疊加的效果是減弱了因蛋白質(zhì)種類所導(dǎo)致的誤差。

表6 凱氏定氮法、CBB法和Lowry法測(cè)定結(jié)果比較Table 6 Comparison of determination results by Kjeldahl,CBB and Lowry Method

3.4 干擾物添加實(shí)驗(yàn)比較

表7 大米樣品添加干擾物實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Interference effect of supplements to protein determination of rice

由表7實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本次實(shí)驗(yàn)嘗試的非蛋白氮干擾物中，三聚氰胺的加入量低于300 g/kg時(shí)，對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯干擾作用，誤差基本保持在3%以內(nèi)，相比而言，對(duì)CBB法的影響更大一點(diǎn)。尿素的含量在低于100 g/kg時(shí)，對(duì)測(cè)定結(jié)果基本沒有影響，而隨著加入量的繼續(xù)增加，CBB法和Lowry法的測(cè)定數(shù)據(jù)均有一定程度的下降，其中CBB法表現(xiàn)更為明顯。硫酸銨對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定的影響最為微弱，添加量超過50 g/kg時(shí)，蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

4 討論

（1）凱氏定氮法不是直接測(cè)出蛋白質(zhì)的含量，而是通過測(cè)定樣品中氮元素的總含量來(lái)間接計(jì)算蛋白含量。通常情況下，糧食和食品中的含氮物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)，因此利用凱氏定氮法測(cè)蛋白含量一般來(lái)說(shuō)比較可靠?？墒牵坏┯腥嗽跇悠分刑砑臃堑鞍缀镔|(zhì)，這個(gè)方法就不那么準(zhǔn)確了，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果會(huì)不同程度地偏高，從而帶有虛假性和誤導(dǎo)性。

（2）CBB法操作簡(jiǎn)單，只需加入一種染料；反應(yīng)迅速，大約要2 min可以完成，且顯色結(jié)果能在1 h之內(nèi)保持穩(wěn)定，較Lowry法省時(shí)。但此法的缺點(diǎn)是由于考馬斯亮藍(lán)G-250與不同種類蛋白質(zhì)的結(jié)合能力存在差異，因此可能引起不同程度的偏差。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與凱氏定氮法相比有較明顯的偏低，從78.22%到80.33%不等[11-13]。

（3）Lowry法作為一種公認(rèn)的測(cè)定微量蛋白的方法，因其作用機(jī)制是由兩步疊加的顯色反應(yīng)組成，克服了CBB法由蛋白質(zhì)種類引起偏差的缺點(diǎn)[14-17]。但是Lowry法存在試劑乙的配制較為繁瑣、需嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間以及耗時(shí)長(zhǎng)等弊端，不過可以利用商品化的試劑盒，解決這一問題。本實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)含量測(cè)定的結(jié)果與凱氏定氮法相當(dāng)，與前人文獻(xiàn)所述大體相同[18,19]。

三種方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白和大米蛋白的測(cè)定結(jié)果顯示：Lowry法的測(cè)定數(shù)據(jù)與凱氏定氮法的符合度達(dá)到90%以上，而CBB法的測(cè)定結(jié)果則較凱氏定氮法呈現(xiàn)偏低的趨勢(shì)，平均符合度為70%～80%，從而得出：Lowry法準(zhǔn)確度更高。

5 結(jié)論

文章在非蛋白氮干擾物的添加實(shí)驗(yàn)中，采用CBB法和Lowry法作為蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法時(shí)，三種干擾物對(duì)大米蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果均無(wú)明顯干擾作用。三聚氰胺在加入量低于300g/kg時(shí)對(duì)CBB法和Lowry法的測(cè)定結(jié)果基本無(wú)影響；尿素和硫酸銨對(duì)這兩種方法測(cè)定結(jié)果的干擾也較小，隨著添加量的增加，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。三聚氰胺作為一種化工原料，動(dòng)物（及人類）長(zhǎng)期攝入會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，引起尿路結(jié)石，所以我國(guó)嚴(yán)禁在食品、飼料中添加三聚氰胺。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以推測(cè)：在加強(qiáng)國(guó)家食品藥品監(jiān)管力度的同時(shí)，以凱氏定氮法為參考，選用其他一種或多種蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，盡量降低甚至避免非蛋白氮的干擾，以求更加準(zhǔn)確地測(cè)定食品和飼料中蛋白質(zhì)的實(shí)際含量，為人類和動(dòng)物的健康筑起一道堅(jiān)固的防線。