1.蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2. 蘭州現(xiàn)代職業(yè)學院，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅省高校中(藏)藥化學與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

五味清肺固本膠囊是蘭州市肺科醫(yī)院傳統(tǒng)制劑，處方由白及、百部、冬蟲夏草等5味中藥組成，具有滋肺益腎、止咳化痰、消腫生肌的功效。方中百部的主要活性成分為百部生物堿，是百部科植物所特有的吡咯或吡啶并氮雜薁母核結構的生物堿，有殺蟲、鎮(zhèn)咳平喘、抗腫瘤和抗菌等藥理作用[1]；白及的主要活性成分為多糖類，有收斂、止血、消腫生肌等作用[2]。五味清肺固本膠囊是在散劑的基礎上經(jīng)過劑型改造發(fā)展而來，原制劑服用量大而患者的依存性較差，對制劑的臨床使用有一定的影響。研究采用L9(34)正交試驗設計，依據(jù)中藥復方藥理作用的整體性，中藥成分和作用機制復雜性的作用特點，主要對制劑生產(chǎn)中的總生物堿、總多糖的轉(zhuǎn)移率進行考察，并在制備過程中采用精制除雜，可以減少制劑的服用量，同時符合中藥現(xiàn)代化的要求。以多指標綜合評分法優(yōu)選提取工藝條件的實驗研究，也為該制劑的質(zhì)量標準提升提供了基礎[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2450紫外分光光度計(島津)；FA2004B電子天平(北京賽多利斯儀器公司)；RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 藥材均購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)楊懷武高級工程師鑒定均符合《中國藥典》2015 年版一部相關項下規(guī)定；三批樣品為我院實驗中心自制，批號分別為20171210、20171211、20171212；D-無水葡萄糖對照品(批號：110833-201205，中國食品藥品鑒定研究所)；對葉百部堿對照品(批號：6879-01-2，上海源葉生物科技有限公司)；純化水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 干膏得率的測定 按照L9(34)正交表安排進行提取操作，100目篩趁熱過濾，合并提取液，濃縮后定容到250 mL量瓶中，精密量取50 mL，置干燥恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，取出至干燥器中冷卻30 min、迅速精密稱定，計算干膏得率。

2.2 總多糖含量的測定[4-8]

2.2.1 供試品溶液的配制 精密稱取正交試驗6號樣品浸膏粉約0.15 g，置于10 mL容量瓶中，加水充分溶解并定容至刻線，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，以3500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，精密吸取上清液1 mL于離心管中，加入無水乙醇9 mL，至刻以3500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，傾去上清液，沉淀用無水乙醇洗滌3次后，加水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容至刻線，搖勻即得。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取D-無水葡萄糖對照品11 mg,置于50 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻線，搖勻即得濃度為0.22 mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液。

2.2.3 檢測波長的選擇 分別精密吸取供試品溶液和D-無水葡萄糖對照品溶液適量于10 mL具塞試管中，加水至2 mL，分別加入5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，搖勻后于60 ℃水浴保溫30 min，取出，放至室溫，以水為空白，按照紫外—可見分光光度法在200～800 nm進行掃描，結果D-無水葡萄糖對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為490 nm，故選擇490 nm為檢測波長。

2.2.4 線性關系的考察 精密吸取0.22 mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液5 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻線，搖勻，即得濃度為0.11 mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按“2.1.3”項下的方法處理后，在波長490 nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度(x，μg·mL-1)橫坐標、吸光度(y)為縱坐標，得回歸方程為y=0.0574x+0.0101(r2=0.9980)。結果表明D-無水葡萄糖在2.75～13.75 μg·mL-1呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 分別精密吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.3 mL于6支具塞試管中，加水至2 mL，按“2.2.3”項下的方法處理后，在波長490 nm處測定吸光度并計算RSD。結果RSD=1.55%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.1” 項下供試品溶液，按“2.2.3”項下的方法處理后，分別在0、15、30、45、60、90、120 min測定其吸光度并計算RSD。結果RSD=0.17%(n=7)，表明該方法處理后的溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗 精密吸取“2.2.1” 項下供試品溶液，按“2.2.3”項下的方法處理后，在波長490 nm處測定吸光度，并計算樣品中總多糖含量的RSD。結果RSD=2.56%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的樣品適量，按“2.2.1”項下的方法制備后，分精密吸取0.5 mL于具塞試管中，共9份，分別精密加入0.22 mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，加水至2 mL，按“2.2.3”項下的方法處理后，在波長490 nm處測定吸光度并計算總多糖含量及加樣回收率，結果見表1。結果平均加樣回收率為101.16%，RSD=1.88%(n=9)，表明該方法準確性良好。見表1。

2.2.9 樣品中總多糖含量的測定 精密稱取L9(34)正交試驗樣品適量，按“2.2.1”項下的方法制備并按“2.2.3”項下的方法處理后，在波長490 nm處測定吸光度，計算樣品中總多糖含量。

2.3 總生物堿含量的測定[9-10]

2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取正交試驗6號樣品浸膏粉約1 g于錐形瓶中，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液定容于25 mL容量瓶中，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取對葉百部堿對照品19.5 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻線，搖勻，即得0.78 mg·mL-1的對葉百部堿對照品溶液。

表1 加樣回收率試驗

2.3.3 檢測波長的選擇 分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液適量于分液漏斗中，加入pH 6.6磷酸鹽緩沖液5 mL和溴百里香酚藍試液3 mL，搖勻，用氯仿萃取2次，每次10 mL，取下層液于25 mL容量瓶中，用氯仿定容至刻線，搖勻。以甲醇為空白試劑，按照紫外—可見分光光度法在200～800 nm進行掃描，結果對葉百部堿對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為412 nm，故選擇412 nm為檢測波長。

2.3.4 線性關系的考察 精密吸取對葉百部堿對照溶液1 mL，按“2.3.3”項下的方法處理，分別取2、4、6、8、10 mL于具塞試管中，加氯仿至10 mL，搖勻，以甲醇為空白試劑，于412 nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度(x，μg·mL-1)橫坐標、吸光度(y)為縱坐標，得回歸方程為y=0.0262x-0.1001(r2=0.9987)。結果表明對葉百部堿在6.24～31.2 μg·mL-1呈良好的線性關系。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取對葉百部堿對照溶液1 mL于分液漏斗中，共6份，按“2.3.4”項下的方法處理后，在波長412 nm處測定吸光度并計算RSD。結果RSD=1.20%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液1 mL于分液漏斗中，按“2.3.4”項下的方法處理后，分別在0、10、20、30、40、60、90 min測定其吸光度并計算RSD。結果RSD=0.24%(n=7)，表明該方法處理后的溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復性試驗 精密吸取“2.3.1”項下的方法制備的供試品1 mL，共6份，按“2.3.4”項下的方法處理后，測定吸光度并計算樣品中總生物堿含量的RSD。結果RSD=1.10%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密吸取“2.3.1”項下的方法制備的供試品0.5 mL，共9份。分別精密加入0.78 mg·mL-1的對葉百部堿對照品溶液0.28、0.35、0.42 mL，按“2.2.4”項下的方法處理后，測定吸光度并計算總生物堿含量及加樣回收率，結果見表2。結果平均加樣回收率為101.60%，RSD=2.13%(n=9)，表明該方法準確性良好。見表2。

2.3.9 樣品中總生物堿含量的測定 精密稱取L9(34)正交試驗樣品適量，按“2.3.1”項下的方法制備并按“2.3.3”項下的方法處理后，在波長412 nm處測定吸光度，計算樣品中總生物堿含量。

表2 加樣回收率試驗

2.4 正交試驗優(yōu)選提取工藝及結果 依據(jù)前期實驗，確定本組方藥效成分為水溶性成分，因此設計提取溶劑為水。按處方比例稱取百部、白及等藥材共94.5 g(除冬蟲夏草)，共9份。選用L9(34)正交設計進行試驗，根據(jù)處方中藥材有效成分的作用，以浸泡時間、加水總倍數(shù)、提取總時間和提取次數(shù)作為考察因素,以總多糖提取率、總生物堿提取率和干膏得率作為考察指標，因素與水平(見表3)。利用SPSS 19.0對正交試驗結果進行分析(見表4、5)。由極差分析結果可知，各因素對綜合評分的影響大小順序為C>D>B>A；由方差分析可知，因素C、D對綜合評分具有極顯著性影響(P<0.01)，因素B對綜合評分具有顯著性影響(P<0.05)，因素A對綜合評分無顯著性影響(P>0.05)。綜合分析得出最優(yōu)提取工藝為A1B3C3D3，即總加水32倍，浸泡0.5 h，提取3次，提取總時間為3 h。

表3 因素水平表

注：提取2次時每次的加水倍數(shù)分別為：加水總倍數(shù)/2+1、加水總倍數(shù)/2-1；提取3次時每次的加水倍數(shù)分別為：(加水總倍數(shù)-2)/3+2、(加水總倍數(shù)-2)/3、(加水總倍數(shù)-2)/3；每次的提取時間為：提取總時間/提取次數(shù)。

表4 正交試驗結果

表5 綜合評分方差分析結果

2.5 權重系數(shù)及綜合評分公式的確定[11-12]采用層次分析法(Analytic Hierarchy Process，AHP)并綜合考慮五味清肺固本膠囊的現(xiàn)代藥理研究，得到總生物堿、總多糖和出膏率的AHP法權重系數(shù)分別為0.5815、0.3090、0.1095，經(jīng)一致性檢驗，其一致性比率(CR)=CI/RI =0.0036/0.58=0.0062 < 0.1，表明指標優(yōu)先比較判斷陣距具有一致性，權重系數(shù)合理、有效。最終得到的綜合評分=總生物堿提取率/最大總生物堿提取率×0.5815+總多糖提取率/最大總多糖提取率×0.3090+出膏率/最大出膏率×0.1095。

2.6 提取工藝驗證試驗 按比例稱取同一批百部、白及等藥材適量，平行3份，按照最優(yōu)工藝進行提取。結果平均出膏率為43.91%，RSD為1.50%；平均總多糖提取率為4.96%，RSD為2.10%；平均總生物堿提取率為0.50%，RSD為0.90%；平均綜合評分0.9338，RSD為1.08%，表明該工藝穩(wěn)定可行。見表6。

表6 驗證試驗結果

3 討論

3.1 有效部位的確定和多指標綜合評分 五味清肺固本膠囊由白及、百部、冬蟲夏草等5味中藥組成，藥效成分主要為生物堿、多糖等成分。本提取工藝的優(yōu)化設計是建立在中藥藥效學和復方制劑藥效的整體性、多靶點、多途徑特點的基礎上，貫穿質(zhì)量源于設計的思路，充分考慮五味清肺固本膠囊中百部、白及等藥材的藥效部位，如抑菌、止咳平喘、止血等成分的理化性質(zhì)與提取溶劑、提取方法的關系，以總生物堿、總多糖和干膏得率為評價目標，結合層次分析法確定各指標權重，采用多指標綜合評分法分析優(yōu)選提取工藝。

3.2 制備工藝和檢測方法的優(yōu)化 本實驗在五味清肺固本膠囊的制備中采用傳統(tǒng)的溶劑提取法，在提取液多糖的制備過程中，利用多糖溶于水而不溶于無水乙醇的性質(zhì)，采用兩步離心法結合醇沉法，第一步對提取液的離心可以較大程度的除去其中的蛋白質(zhì)、糊化淀粉、油脂等雜質(zhì)；第二步是用90%的醇沉后離心，以此降低多糖純化成本，也可以減少多糖類成分的損失；在總多糖含量測定方法的選擇上，選用簡便、靈敏度高的苯酚-硫酸法，進一步避免了復方提取液中蛋白質(zhì)等成分對含量測定的影響。選用酸性染料比色法測定百部總生物堿的含量，該方法是離子對萃取比色法中比較經(jīng)典方法，以溴百里香酚藍為酸性染料亦最大程度地減少對檢測結果干擾。

3.3 工藝優(yōu)選對臨床應用和制劑質(zhì)量的影響 五味清肺固本膠囊是在散劑的基礎上通過劑型改造發(fā)展而來，采用L9(34)正交設計試驗優(yōu)選的提取工藝最大限度的保證了藥材中藥效部位提取程度，也保證了制劑的臨床療效。同時，經(jīng)過精制除雜過程，除去了提取液中的一些蛋白類、淀粉等物質(zhì)，較原制劑減少了服用量，提高患者的用藥依存性。通過對提取工藝的研究，在制劑的生產(chǎn)過程中，可以用總多糖和總生物堿作為中間品控制的定量指標，進一步提升制劑的質(zhì)量。