王夢瑤 任敦強(qiáng) 郭彩宏 丁曉倩 王紅梅

目前，肺癌是中國和世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，多數(shù)確診時已處于肺癌晚期，傳統(tǒng)的放化療療效有限，中位生存時間僅為8個月-10個月，而隨著人們對分子生物學(xué)及基因水平的研究，分子靶向治療得到快速發(fā)展，使肺癌患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）及總生存期（overall survival,OS）延長，生活質(zhì)量也有所提升。目前表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是迄今為止非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）靶向治療研究中最成功的受體之一。研究[1]發(fā)現(xiàn)亞洲人EGFR突變發(fā)生率達(dá)50%-60%，EGFR突變主要存在于18-21外顯子中，其中19和21單一外顯子突變最常見，約占EGFR總突變的90%。目前對于NSCLC中EGFR常見突變的研究已經(jīng)非常廣泛，大量文獻(xiàn)報道得出EGFR常見突變在女性、無或少吸煙史、腺癌患者中發(fā)生率較高[2]。大量III期隨機(jī)臨床研究已經(jīng)證實(shí)：EGFR突變的NSCLC患者應(yīng)用EGFR酪氨酸酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）治療，PFS達(dá)到9個月-13個月，OS延長至20個月-30個月?；谶@些臨床研究已經(jīng)將EGFR-TKIs納入突變型晚期NSCLC一線標(biāo)準(zhǔn)化治療[3,4]。但隨著研究的深入，越來越多罕見突變被發(fā)現(xiàn)，例如：18外顯子的G719X、20外顯子的S768I、21外顯子的L861Q，還有我們目前已知的20外顯子耐藥基因T790M。除罕見單基因突變外，EGFR雙基因突變也有相應(yīng)文獻(xiàn)報道過，但由于雙突變的發(fā)生率低，樣本量小，EGFR雙突變患者的臨床特征以及對EGFR-TKIs治療的敏感性仍未完全明確。故本研究擬分析就診于本醫(yī)療中心的59例EGFR雙突變NSCLC患者的臨床特征及EGFR-TKIs治療療效，從而為EGFR雙突變患者提供臨床數(shù)據(jù)及治療依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月1日-2016年12月31日就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受EGFR基因檢測的原發(fā)性NSCLC患者，所有患者均經(jīng)病理組織活檢證實(shí)為NSCLC，且均由上海泛亞公司統(tǒng)一采用ARMS-PCR技術(shù)進(jìn)行EGFR基因檢測。對EGFR雙突變和單突變患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，比較EGFR雙突變與單突變患者在臨床特征上是否具有明顯差異。根據(jù)實(shí)體瘤的療效評價標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumor,RECIST）來評價使用EGFR-TKIs治療的EGFR突變型患者的客觀緩解率（objective response rate,ORR）、疾病控制率（disease control rate,DCR）、無進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS），比較EGFR單、雙突變患者治療療效之間的差異。

臨床資料入組標(biāo)準(zhǔn)：具有完整的醫(yī)療資料，包括性別、年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis,TNM）分期（TNM分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會第七版TNM分類決定，以IIIa期為界，具體分為早期和晚期）。

治療療效入組標(biāo)準(zhǔn)：①確診后一線經(jīng)EGFR-TKIs治療，每天服用吉非替尼250 mgqd、厄洛替尼150 mgqd或?？颂婺?25 mgtid治療，靶向治療期間未接受其他放化療、粒子植入及手術(shù)治療。②具有規(guī)律的復(fù)診記錄，能提供相關(guān)檢測數(shù)據(jù)（肺、顱腦、全腹、骨掃描等影像學(xué)及腫瘤標(biāo)志物血液指標(biāo)）。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，EGFR單、雙突變與臨床特征之間的相關(guān)性分析用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EGFR單、雙突變PFS之間用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。

2 結(jié)果

2.1EGFR突變頻率 2015年1月1日-2016年12月31日就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受EGFR基因檢測的原發(fā)性NSCLC患者共搜集到1,238例，其中EGFR單突變患者603例，突變概率為48.71%；EGFR雙突變患者59例（手術(shù)患者24例，非手術(shù)患者35例），突變概率為4.77%；雙突變占EGFR總突變患者概率為8.91%；雙突變患者中18/20外顯子突變?nèi)藬?shù)21例（35.59%），19/20外顯子突變?nèi)藬?shù)8例（13.56%），19/21外顯子突變?nèi)藬?shù)11例（18.64%），20/21外顯子突變?nèi)藬?shù)19例（32.20%）；由于臨床資料在收集過程中存在部分?jǐn)?shù)據(jù)丟失，59例雙突變患者中明確具體基因分型的只有32例，32例雙突變患者具體突變基因型分布見表1。

2.2 臨床特征分析 59例雙突變患者中有4例門診失訪，缺失完整的醫(yī)療資料，納入雙突變臨床資料組患者共55例。從單突變患者中進(jìn)行分層隨機(jī)抽樣，選取60例納入單突變臨床資料組。對兩組患者的臨床特征進(jìn)行分析，包括性別、年齡、吸煙史、病理類型、TNM分期，基線特征見表2。

其中單突變資料組女性（63.33%）、無吸煙史（68.33%）、腺癌（96.67%）患者多見，18外顯子突變1例（1.67%）、19外顯子突變31例（51.67%）、20外顯子突變2例（3.33%）、21外顯子突變26例（43.33%），均與文獻(xiàn)報道一致。雙突變與單突變患者在性別、吸煙史、年齡、病理類型、TNM分期等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 治療療效分析 雙突變患者中共24例接受EGFR-TKIs治療，包括非手術(shù)患者19例，術(shù)后復(fù)發(fā)患者5例。術(shù)后復(fù)發(fā)患者中1例靶向治療同時聯(lián)合放化療，另1例同時聯(lián)合粒子植入治療。將僅接受EGFR-TKIs治療的19例非手術(shù)患者納入雙突變治療療效組，從單突變患者中選取僅接受EGFR-TKIs治療的20例非手術(shù)患者納入單突變治療療效組，根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，回顧性分析兩組的ORR、DCR及PFS。

2.3.1 ORR、DCR比較 20例EGFR單突變治療療效組患者中，12例部分緩解（partial response,PR），6例病情穩(wěn)定（stable disease,SD），2例病情進(jìn)展（progressive disease,PD）。19例EGFR雙突變治療療效組患者中，7例獲得PR，6例SD，6例PD。將EGFR單突變組和雙突變組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：ORR為60.00%vs36.80%（χ2=2.092,P=0.205）；DCR為90.00%vs68.40%（χ2=2.783,P=0.127）。差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2 PFS比較 雙突變治療療效組平均PFS為7.4個月，中位PFS為6.0個月，單突變治療療效組平均PFS為13.9個月，中位PFS為12.0個月，兩組比較有顯著差異（χ2=8.863,P=0.003）。術(shù)后復(fù)發(fā)僅接受EGFR-TKIs治療的3例雙突變患者中，平均PFS為17.0個月，中位PFS為15.0個月。具體包括3種不同基因分型，突變基因?yàn)镾768I/L861Q型患者，接受克唑替尼治療，PFS為15個月，突變基因?yàn)镚719X/S768I型患者，接受厄洛替尼治療，PFS為26個月，突變基因?yàn)?9del/L858R型患者，接受克唑替尼治療，PFS為10個月。

表1 32例雙突變患者具體基因型分布Tab 1 Specific genotype distribution in 32 patients with double mutation

3 討論

本研究單突變臨床資料組符合女性、無吸煙史、腺癌患者發(fā)生率高，19和21外顯子位點(diǎn)突變共占95%，這與目前眾多文獻(xiàn)得出的結(jié)論一致。雙突變臨床資料組與單突變臨床資料組進(jìn)行比較，P值均大于0.05，說明雙突變患者在性別、年齡、吸煙史、病理類型、TNM分期上與單突變患者不具有顯著性差異。周欣[5]曾在文章中報道過6例L858R復(fù)合雙突變患者與18例單突變患者的臨床特征，發(fā)現(xiàn)單雙突變之間無顯著性差異，這與本研究結(jié)果相一致。

圖1 雙突變組和單突變組無進(jìn)展生存期比較Fig 1 The comparison of progression-free survival in double mutation and single mutation

表2 EGFR單突變和雙突變患者臨床特征比較Tab 2 Comparison of clinical features of EGFR single mutation and double mutation

本研究應(yīng)用EGFR-TKIs治療的單、雙突變患者中，單突變和雙突變患者的ORR（60.00%vs36.80%），DCR（90.00%vs68.40%），可能由于本研究樣本量較小，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但EGFR雙突變患者應(yīng)用EGFR-TKIs治療的有效率明顯低于單突變患者。單突變患者的中位PFS為12.0個月，雙突變患者中位PFS僅為6.0個月，與單突變患者比較（P＜0.01）具有顯著差異。提示EGFR雙突變晚期NSCLC患者應(yīng)用EGFR-TKIs治療的預(yù)后不如EGFR單突變患者。本研究收集18/20、19/20、19/21、20/21外顯子雙突變患者例數(shù)分別為21例、8例、11例、19例，而相同突變型之間的PFS具有一定的差異性，可能與具體基因分型有關(guān)。雙突變的具體基因型是多樣的，可為常見單突變復(fù)合常見單突變、常見單突變復(fù)合罕見單突變、罕見單突變復(fù)合罕見單突變，也可能是合并已知耐藥基因的復(fù)合突變。本研究中已知具體基因分型的32例雙突變患者中只有2例為常見單突變基因復(fù)合（19del/L858R），其他均復(fù)合罕見單突變基因，主要包括G719X、S768I、T790M、20-ins、L861Q，其中S768I/G719X雙突變類型最常見，達(dá)到43.8%，這與Chen[6]的部分研究相吻合，他認(rèn)為發(fā)生雙突變的基因多復(fù)合罕見單突變基因，罕見單突變基因相較于常見突變基因，致癌基因較弱，往往不能單獨(dú)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，需要復(fù)合成為雙突變基因才能導(dǎo)致腫瘤的形成。楊雪等[7]也曾得出雙突變中以S768I合并G719X最為常見的結(jié)論。本研究中單突變和雙突變治療療效組之間存在顯著性差異，可能與雙突變組易復(fù)合罕見突變基因有關(guān)。常見突變基因如19位點(diǎn)的缺失突變和21位點(diǎn)的L858R點(diǎn)突變經(jīng)EGFR-TKIs治療療效已經(jīng)得到充分證實(shí)，能使PFS和OS時間明顯延長，但目前對于罕見型EGFR突變經(jīng)EGFR-TKIs治療預(yù)后都較差。此前大量研究認(rèn)為20外顯子的插入突變和20外顯子的T790M突變對EGFR-TKIs耐藥[8,9]。T790M突變的作用已被證實(shí)與原發(fā)性和獲得性耐藥相關(guān)，應(yīng)用EGFR-TKIs治療6個月-10個月后可出現(xiàn)T790M獲得性耐藥突變。對于20外顯子插入突變，Woo等[10]報道過6例，應(yīng)用EGFR-TKIs治療整體預(yù)后都較差，其中有2例在治療1個月內(nèi)即出現(xiàn)疾病進(jìn)展。Wu[11]報道過2例，應(yīng)用一代EGFR-KTIs治療后的PFS分別為1個月和1.5個月。由此可看出20外顯子插入突變患者EGFR-TKIs治療效果差。日本的Staoshi[12]在NEJ002研究中，發(fā)現(xiàn)罕見突變G719X或者L861Q突變的患者應(yīng)用吉非替尼治療后，中位PFS為2.2個月，中位生存期為12個月，總生存期明顯短于常見突變，并認(rèn)為具有少見突變的NSCLC患者接受一線化療比接受一線靶向治療效果更好。韓國的Baek等[13]研究的13例具有G719X或者L861Q的單一突變或者復(fù)合突變的患者，應(yīng)用EGFR-TKIs治療后，中位PFS為5.1個月，中位生存期為18.6個月。Kancha等[14]通過比較EGFR單突變對不同EGFR-TKIs的50%抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50），得出L861Q對于一代靶向藥物均不敏感，需要較高的藥物濃度來達(dá)到和常見突變一樣的抗腫瘤效果，而S768I和L861Q相比較，IC50則更高，表明S768I可能對一代靶向藥物耐藥。段樺[15]通過分析國內(nèi)外文獻(xiàn)得出S768I單一突變患者較常見突變對一代EGFR-TKIs應(yīng)答差。通過以上眾多研究我們可以得出EGFR罕見突變對EGFR-TKIs治療效果的敏感性不如常見突變。本研究中19例非手術(shù)雙突變患者一線均接受一代EGFR-TKIs藥物治療，中位PFS僅為6.0個月，推測可能與罕見單突變基因影響了常見突變基因?qū)GFR-TKIs敏感性有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前隨著分子水平研究的深入，大量研究已經(jīng)提出腫瘤異質(zhì)性與治療療效以及耐藥性相關(guān)，Gerlinger等[16]對4例腎癌患者的30個腫瘤樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)26個樣本具有不同的等位基因，甚至在同一腫瘤的不同部位中，檢測出預(yù)后良好和預(yù)后不良的基因。本研究中EGFR基因檢測均來自于組織活檢，采用ARMS-PCR技術(shù)，由于腫瘤異質(zhì)性，利用小塊組織檢測到的變異可能無法完全反映病灶部位全部細(xì)胞變異情況，檢測到的EGFR突變豐度也會具有一定的異質(zhì)性。目前眾多關(guān)于EGFR突變豐度的研究認(rèn)為，EGFR突變基線豐度值可能與EGFR-TKIs治療療效呈正相關(guān)，EGFR突變豐度變化還可以反映疾病動態(tài)變化。Yang[17]的研究發(fā)現(xiàn)高豐度突變患者比低豐度突變患者具有更好的PFS，在經(jīng)EGFR-TKIs治療后逐漸進(jìn)展的患者中，突變豐度降低的患者組獲得更好的PFS和OS。由此我們可以推斷本研究中相同基因分型患者之間PFS存在差異的原因可能與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)。

目前相關(guān)研究已經(jīng)得出EGFR罕見突變患者應(yīng)用一代EGFR-TKIs治療，敏感性介于敏感突變和野生型之間，而二代EGFR-TKIs治療可以獲得更好的預(yù)后。Yang等[18]證實(shí)了二代EGFR-TKIs阿法替尼對于G719X罕見突變型的客觀緩解率達(dá)78%，中位PFS可達(dá)13.8個月，明顯優(yōu)于一代EGFR-TKIs。Kancha等[14]通過試驗(yàn)也證實(shí)了罕見突變接受一代EGFR-TKIs治療有效率低。楊雪[7]分析了不同類型的EGFR少見突變基因，發(fā)現(xiàn)大部分?jǐn)y帶少見突變的患者接受EGFR-TKIs治療的ORR和PFS均較經(jīng)典敏感性突變低，但較EGFR野生型患者高，與一代EGFR-TKIs相比，二代EGFR-TKIs可能更適用于EGFR少見突變的治療。本研究中雙突變患者一線均采用一代EGFR-TKIs治療，無論是ORR、DCR還是PFS，均較EGFR單突變患者低。其中2例進(jìn)展后更換為二代EGFR-TKIs治療，二代EGFR-TKIs治療后的PFS分別為12個月和9個月。結(jié)合本研究中已知具體基因分型的32例雙突變患者中有30例均復(fù)合罕見單突變基因，我們初步預(yù)測EGFR雙突變患者經(jīng)二代EGFR-TKIs治療可以獲得更好的預(yù)后。

本研究術(shù)后復(fù)發(fā)患者中，有3例僅接受EGFR-TKIs治療，中位PFS為15個月，是否可以預(yù)測雙突變術(shù)后復(fù)發(fā)患者應(yīng)用EGFR-TKIs治療預(yù)后較好。相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)得出EGFR敏感單突變術(shù)后復(fù)發(fā)NSCLC患者應(yīng)用EGFR-TKIs治療能獲得較好的預(yù)后。術(shù)后復(fù)發(fā)雙突變患者是否與單突變患者擁有相同的治療效果，仍需要進(jìn)一步大樣本研究驗(yàn)證。

綜上所述，EGFR雙突變患者的基因分型易合并罕見突變基因，以G719X/S768I突變型最常見。雙突變患者臨床特征與單突變患者之間無顯著性差異。雙突變患者接受一代EGFR-TKIs治療的ORR、DCR、PFS均較單突變患者低，二代EGFR-TKIs可能更適應(yīng)于EGFR雙突變患者。由于EGFR雙突變發(fā)生率很低，目前對于此類研究很少，本研究收集的樣本量小，同時雙突變又有許多不同的基因分型，在樣本采集過程中無法獲得所有的具體基因型，因此還需要進(jìn)一步大量的研究來更加深入地了解EGFR雙突變患者的臨床特征及其對EGFR-TKIs治療的反應(yīng)從而指導(dǎo)臨床實(shí)踐。