田曉玲

(遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016)

磺胺類藥物（Sulfonamides）是以對氨基苯磺酰胺為基本結(jié)構(gòu)的衍生物，新型藥物發(fā)展迅速，逐漸形成以短效、中效和長效分類的系列抗菌藥物，并以療效確切、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉、使用方便等優(yōu)勢成為最廣泛的臨床用藥之一。但由于磺胺類藥物能發(fā)生過敏反應(yīng)，對泌尿系統(tǒng)有損害，長期使用而耐藥等副作用以及在動物抗感染治療中不規(guī)范的使用，造成動物性食品中的殘留對人類和環(huán)境的危害和污染。歐盟、美國等發(fā)達(dá)國家及我國都規(guī)定了磺胺類藥物在動物性食品中的最高殘留限量，并被列入動物食品中重點監(jiān)控的藥物之一。一些非法企業(yè)為謀求藥效，會在中獸藥散劑中添加磺胺類藥物，造成動物性食品藥殘超標(biāo)，嚴(yán)重威脅人類健康。檢測獸藥中非法添加物常用的方法有高效液相色譜法（HPLC）法和液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）法[1-3]，但因串聯(lián)質(zhì)譜儀要求條件較高，價格昂貴，使普及應(yīng)用受到限制。但現(xiàn)有的HPLC法同時檢測的磺胺類藥物較少[4-6]，在實際檢測中效率不高。本研究針對獸藥中非法添加的中國獸藥典收載及獸醫(yī)臨床應(yīng)用較多的10種磺胺類藥物進(jìn)行了HPLC方法研究，為同時檢測非法添加的多種磺胺類藥物提供一種靈敏、快速、低成本、高通量的新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters 2695高效液相色譜儀，Waters公司；AE260電子天平，Mettler-toledo公司；KQ-250超聲波清洗器，昆山超聲波儀器有限公司。

1.2 藥品和試劑 磺胺嘧啶（批號100026-201404，純度99.7%），磺胺間甲氧嘧啶（批號510093-201401，純度97.5%），購自中國食品藥品檢定研究院；磺胺氯吡嗪（批號H0281308），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磺胺醋酰（批號107118，純度99.0%）、磺胺吡啶（批號101168，純度99.0%）、磺胺二甲基嘧啶（批號91440，純度99.0%）、磺胺氯噠嗪（批號G119228，純度99.1%）、磺胺甲惡唑（批號121573，純度99.0%）、磺胺二甲氧嘧啶（批號40903，純度99.5%）、磺胺喹噁啉（批號41219，純度99.0%），均購自德國Dr Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇為色譜純，F(xiàn)ISHER公司；乙酸為分析純；水為超純水。

2 試驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱為C18柱，150 mm×4.6 mm（i.d.）,粒徑5 μm；流動相：乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量為10 μL。10種磺胺類藥物在該條件下的色譜圖見圖1。

圖110 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of 10 sulfonamides reference

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別精密稱取10種對照品適量，置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成濃度均為50、100、200、400、800 ng/mL的系列混合對照溶液，由低濃度到高濃度進(jìn)樣，外標(biāo)法定量，峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.4 供試品溶液的制備 取樣品1.00±0.05 g于100 mL容量瓶中，甲醇定容，超聲30 min，濾膜過濾后，供液相色譜儀測定。

2.5 檢測限的測定 將適當(dāng)濃度的10種磺胺類藥物加入到空白中藥制劑中，制成2、5、10、20 mg/g 4個濃度的添加樣品，經(jīng)上述方法前處理后，用HPLC檢測，觀察藥物色譜峰信噪比（S/N）和對應(yīng)藥物濃度，S/N大于3者，定其為檢測限。

2.6 準(zhǔn)確度和精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白制劑中（止痢散）添加5、10、20 mg/g 3個不同濃度進(jìn)行回收率試驗，每一濃度進(jìn)行5個平行試驗，分別考察3個批次，分別計算回收率和批內(nèi)、批間精密度。

3 結(jié)果與討論

3.1 線性范圍10種磺胺類藥物在50～800 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。密度見表2，止痢散添加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。

表110 種磺胺類回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 The regression equation and correlation coefficient of 10 sulfonamides

3.3 檢測限 按2.5方法進(jìn)行處理，當(dāng)添加濃度為5 μg/g時，測得10種磺胺類藥物S/N大于3，表明方法檢測限為5 μg/g。

表2 止痢散添加回收率Table 2 Recovery of 10 sulfonamides from Zhili San

3.2 準(zhǔn)確度和精密度10種磺胺類藥物在5、10、20 mg/g 3個濃度添加水平的回收率及批內(nèi)、批間精

圖2 空白止痢散中添加10種磺胺類藥物的色譜圖Fig.2 Chromatograms for Zhili San spiked with 10 sulfonamides

3.4 色譜條件的優(yōu)化 采用HPLC法進(jìn)行多種磺胺類藥物檢測，鑒于多組分分離困難。本試驗先后選取了乙腈-0.017 mol/L磷酸（80+20）、乙腈-甲醇-2%乙酸混合溶液梯度洗脫、乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+15+70）、乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）既能實現(xiàn)10種磺胺類藥物的良好分離，又能排除中獸藥的其他雜質(zhì)的干擾，方法簡便、穩(wěn)定，可操作性強(qiáng)。

3.5 提取條件選擇 磺胺類藥物常用的提取方法包括用純有機(jī)溶劑（甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯等），或用有機(jī)溶劑添加一定比例水進(jìn)行提取。本方法采用甲醇溶液作為提溶劑，簡便快速，回收率滿足有關(guān)要求。