梁 喬，張 健 ，申貫?zāi)?，王宏燕，關(guān) 淼，楊洺揚(yáng)，李 蓉

（1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110164）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）隸屬圓環(huán)病毒科，在1974年被當(dāng)作豬腎細(xì)胞中的一種污染物被發(fā)現(xiàn)，PCV1和PCV2是PCV的兩種血清型，PCV1不具有致病性，在正常豬或養(yǎng)殖野豬身上均可存在，PCV2有致病性，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的原發(fā)病原[1-3]。自從PCV2在1998年被發(fā)現(xiàn)后，這種具有有限的編碼能力的單鏈DNA病毒便被作為重要的豬流行病病原之一[4]，該病毒的長度是1.7 kb左右，嚴(yán)重的PCV2感染引起的典型特征是腹股溝淋巴結(jié)腫大。PCV2基因組中有一個(gè)高度保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在單鏈DNA病毒中感染真核生物[5]。通過不同基因型的患病率調(diào)查顯示，PCV2具有較高的變異性，目前已確定的是5種基因型從PCV2a-PCV2e，其中PCV2b和PCV2d是檢出最多的兩種基因型[6]。

本研究通過對(duì)2016年遼寧省14個(gè)市采集的1 580份屠宰場(chǎng)樣本和2017年采集的1 850份屠宰場(chǎng)樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，分析PCV2在遼寧地區(qū)的流行情況，并對(duì)7株P(guān)CV2分離株進(jìn)行全基因組擴(kuò)增并通過測(cè)序進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來源采集屠宰場(chǎng)豬組織樣品，主要包括頜下淋巴結(jié)、肝臟、肺臟、脾臟、扁桃體等。

1.2 主要試劑病毒核酸提取試劑盒（磁珠法），購自蘇州天隆生物科技有限公司；豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測(cè)試劑盒（TaqMan探針法），購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。EX Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP（2.5 mmol/L）、溴化乙錠、DL 2000 DNA Marker、三羥甲基氨基甲烷一乙酸電泳緩沖液購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病料DNA的提取

1.3.1 用無菌鑷剪夾取待檢樣品2.0 g于1.5 mL滅菌離心管中，加入適量生理鹽水后將離心管放入組織研磨器中固定好，3 000 r/min離心5 min，然后將離心管放入臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，將上清液吸入1.5 mL離心管中，同時(shí)做好樣品對(duì)應(yīng)的標(biāo)記。

1.3.2 向蛋白酶K干粉中注入1.4 mL蛋白酶K稀釋液后充分混勻備用，向96孔板中的第1列和第7列分別加入20 μL蛋白酶K和200 μL樣本。

1.4 病料樣品檢測(cè)和PCV 2全基因的擴(kuò)增

1.4.1 病料樣品檢測(cè)50℃2 min，95℃15 min，循環(huán)設(shè)置：94℃15 s→55℃45 s（在第40個(gè)循環(huán)處進(jìn)行熒光的收集）。

1.4.2 PCV2全基因的擴(kuò)增擴(kuò)增PCV2全基因引物由上海生工合成，上游引物為：5’-GTACCTTGTTGGAGCGGG-3’；下游引物為：5’-TCACA GCAGACAGGTCA-3’。檢測(cè)引物PCR反應(yīng)條件：94℃4 min，94℃50 s，56℃50 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。

1.4.3 PCV2全基因生物信息學(xué)分析 采用DNAStar軟件及Clustal W對(duì)測(cè)得的PCV2全基因序列進(jìn)行拼接和比對(duì)，利用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步從PCV2的分子遺傳層面進(jìn)行研究分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV 2的感染情況對(duì)2016～2017年遼寧省14個(gè)市豬場(chǎng)采集的病料進(jìn)行檢測(cè)，其中2016年為1 580份，2017年為1 850份，結(jié)果表明PCV2感染率分別為83.54%、85.62%。具體見表1和表2。

2.2 常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果通過全基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 700 bp附近出現(xiàn)目的片段，將PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序后，證實(shí)所分離的毒株是PCV2。檢測(cè)結(jié)果如圖1。

2.3 PCV 2的全基因擴(kuò)增結(jié)果及進(jìn)化分析從病料樣品中共獲得7株P(guān)CV2的全基因序列，與GenBank中公布的不同類型（PCV2a-PCV2d）的參考毒株對(duì)比分析結(jié)果如圖2。本研究分離到的7株P(guān)CV2毒株之間基因核酸序列同源性為93.9%～100%，與國內(nèi)外20株P(guān)CV2代表毒株基因核酸序列進(jìn)行同源性比較分析發(fā)現(xiàn)，與9株國外代表毒株基因核酸序列同源性為93.7%～99.6%，與11株國內(nèi)其他地區(qū)代表毒株之間的同源性為92.9～99.4%。與國外代表毒株相比，與美國地區(qū)PCV2代表毒株（JX535296）基因核酸序列同源性高達(dá)99.6%，與丹麥地區(qū)PCV2代表毒株（EU148503～505）基因核酸序列同源性最低為93.1%～95.1%，與國內(nèi)代表毒株相比，與同處于東北地區(qū)的黑龍江地區(qū)PCV2毒株（HM038017）基因核酸序列同源性相對(duì)較高為94.7%～99.7%，與臺(tái)灣地區(qū)PCV2毒株（AF364094）同源性相對(duì)較低為93.3%～94.3%，根據(jù)Olvera提出的分型標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的遺傳演化分析結(jié)果如圖3，7株遼寧地區(qū)PCV2毒株中有4株屬于PCV2d基因型，2株屬于PCV2a基因型，1株屬于PCV2b基因型。與代表毒株相比，4株P(guān)CV2d基因型與國內(nèi)廣西（KJ956689）、上海毒株（KF850049）的同源性比較近，2株P(guān)CV2a基因與臺(tái)灣毒株（AF364094）的同源性比較近，1株P(guān)CV2b基因型與國內(nèi)廣西毒株（KJ956689）的同源性比較近。

表1 遼寧地區(qū)不同地區(qū)PCV2病原學(xué)陽性率Table 1 The positive rates of PCV2 in different areas of Liaoning

表 2 遼寧地區(qū)不同季節(jié)PCV2病原學(xué)陽性率Table 2 The positive rates of PCV2 in different quarters of a year in Liaoning

圖 1 PCV2全基因檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The result of PCR samples

3 討論

通過對(duì)2016～2017年遼寧地區(qū)14個(gè)市共3 430份豬屠宰場(chǎng)組織樣本的檢測(cè)可知，遼寧地區(qū)的PCV2的感染率很高，據(jù)報(bào)道世界各地PCV2的感染率都很高，且傳播與變異較快，這與萬青山[6]、曹正等[7]、梁鵬帥[8]的研究結(jié)果一致，從地域分布上來看，兩年間遼西地區(qū)病原學(xué)陽性率都屬最高，分別為90.26%、87.80%，遼中地區(qū)病原學(xué)陽性率相對(duì)偏低；分析原因可能是遼西養(yǎng)殖業(yè)較多、疫病傳播速度快，還有遼西與其他省份毗鄰，也為疫病的傳播提供了地理優(yōu)勢(shì)。

圖 2 PCV2全基因序列同源性比對(duì)Fig.2 Complete genome nucleotide sequence homology comparison of PCV2

圖 3 基于PCV2全基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Complete genome nucleotide sequence phylogenetic tree of PCV2

從時(shí)間分布上來看，春季和夏季的病原學(xué)陽性率要高于秋季和冬季。分析原因可能是由于氣溫較高有助于疾病的感染和傳播。豬群飼養(yǎng)密度、豬只的移動(dòng)和混群、防疫條件等都能增加疾病的感染率，造成該病的擴(kuò)散和傳播。

遺傳演化分析表明，遼寧地區(qū)PCV2的優(yōu)勢(shì)基因型主要是PCV2a、PCV2b、PCV2d，其中PCV2d屬于PCV2b的突變體也稱mPCV2b，是預(yù)防感染PCV2b的病毒性疫苗被大規(guī)模引進(jìn)后產(chǎn)生的基因型，在中國和韓國有逐漸替代PCV2b成為主要的基因型趨勢(shì)，PCV2d也成為第二個(gè)主要的基因型。突變的主要部位是ORF2閱讀框，ORF2的大小是705 bp，編碼了234個(gè)氨基酸，要比普通的PCV2多一個(gè)氨基酸（普通的為233個(gè)氨基酸），ORF2閱讀框3’端原本的TAA終止密碼子變成了AAG（Lys），因此多出一個(gè)氨基酸。PCV2b是在PCV2疫苗免疫失敗發(fā)生PMWS的情況下發(fā)現(xiàn)的，因此也被懷疑這種新的突變體產(chǎn)生了抗原漂移，從而導(dǎo)致疫苗免疫失敗[9-11]。

通過對(duì)遼寧地區(qū)PCV2的分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PCV2感染率極高并呈上升趨勢(shì)，提示亟需高效的PCV2疫苗來實(shí)施免疫并盡量減少毒力反強(qiáng)等現(xiàn)象的發(fā)生。從分子水平分析研究毒株之間的差異，明確了該地區(qū)近幾年的PCV2的毒株的基因亞型及變異趨勢(shì)，另外近幾年P(guān)CV3的出現(xiàn)對(duì)于今后研究的方向也具有一定的指導(dǎo)意義。