靳 娜 孟德維 杜 曉

（1.河北省廊坊市第四人民醫(yī)院，河北 廊坊 065700；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭，014000）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是中老年呼吸系統(tǒng)疾病的常見病和多發(fā)病，流行病學(xué)調(diào)查研究顯示我國COPD發(fā)病率達(dá)8.2%［1］，主要表現(xiàn)為氣道炎癥和肺功能降低。多味中藥均具有改善炎癥反應(yīng)和肺功能的作用，如活血化瘀的三七、葛根，甚至具有養(yǎng)陰功效的生地黃、玄參也具有上述作用。而從中醫(yī)本草理論認(rèn)為，黃芪益氣扶正，對慢性炎癥（正虛邪結(jié)）、肺功能低下（肺氣虧虛）均具有改善作用?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖（APS）是中藥黃芪的主要活性成分之一，有研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有抑制哮喘大鼠呼吸系統(tǒng)炎癥并改善肺功能的藥理學(xué)作用［2-3］，但黃芪多糖對COPD大鼠炎癥反應(yīng)及肺功能的影響的文獻(xiàn)報道尚不多見，本研究將對這一問題進(jìn)行實驗研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量220～250 g，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。 飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 23～25 ℃、相對濕度65%～70%、光照周期12 h∶12 h，正常進(jìn)食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：黃芪多糖購自西安沃森生物科技有限公司（批號：20170120）；醋酸潑尼松片購自天津力生制藥股份有限公司（批號：20170316）；白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司（批號分別為：170106、161129、170305、170226）。 2）儀器：倒置光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；iMark型酶標(biāo)儀（美國 Bio-Rad公司）；HM325型石蠟切片機(jī)（德國Microm公司）；LEAD-7000型多導(dǎo)生理記錄儀（北京豪邁世紀(jì)醫(yī)療器械有限公司）；BG-800型血氣分析儀（梅州康立高科技有限公司）。

1.3 造模與分組 取120只實驗用大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，即正常對照組，模型組，黃芪多糖100、200、400 mg/kg組和潑尼松6 mg/kg組（陽性藥對照組），每組20只。參照李紅梅等［4］報道的實驗方法復(fù)制COPD大鼠模型：造模時間共需28 d，第1日、14日實施麻醉后經(jīng)氣管注入200 μL脂多糖 （1 g/L），第2～28日（第14日除外）置于密封的1 m3煙室中，持續(xù)吸入香煙煙霧30 min（含焦油量19 mg、尼古丁1.2 mg），每日1次；正常對照組不做任何干預(yù)。通過胸部X光片進(jìn)行評估，出現(xiàn)明顯增厚肺組織和陰影形態(tài)不規(guī)則表明COPD模型建立成功［5］，結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠胸部X光片

1.4 干預(yù)方法 造模過程中，黃芪多糖各劑量組（生理鹽水溶解）和潑尼松組（研碎后，生理鹽水溶解）每天注入脂多糖或煙熏前30 min灌胃給予黃芪多糖或強(qiáng)的松，正常對照組同步灌胃給予0.9%氯化鈉注射液。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）大鼠一般生存狀態(tài)及肺組織狀態(tài)的觀察：第29日時，觀察各組大鼠一般生存狀態(tài)，包括大鼠皮毛、飲食、呼吸、體質(zhì)量等。麻醉后取肺組織，肉眼觀察肺組織整體形態(tài)。2）肺臟組織病理學(xué)改變的觀察：取肺臟組織，置于多聚甲醛溶液（濃度4%）固定3 d，然后依次行石蠟包埋、切片、脫蠟水化處理后，行常規(guī)HE染色后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察肺臟組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。3）血清和肺組織炎癥細(xì)胞因子檢測：麻醉后開腹，經(jīng)腹主動脈取血，1500 r/min離心5 min取血清；取血完成后取肺臟組織，于4℃恒溫環(huán)境剪碎后，加入適量冷0.9%氯化鈉注射液制備濃度為10%的肺組織勻漿液，3000 r/min離心10 min取上清液；參照各指標(biāo)ELISA檢測試劑盒操作說明，通過酶標(biāo)儀檢測血清中和肺組織中炎癥細(xì)胞因子IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量。 4）肺功能指標(biāo)檢測及血氣分析：第29日時實施麻醉，行氣管插管后連接多導(dǎo)生理記錄儀測定肺功能指標(biāo)（VE、PEP和FEV1）；頸動脈采血后行血氣分析（PaO2、PaCO2、pH）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計處理。計量資料以（±s）表示，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般生存狀況 正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好、反應(yīng)靈活，皮毛有光澤，飲食正常，體質(zhì)量增長正常，呼吸正常，無呼吸困難、喘息等；模型組大鼠精神不振、反應(yīng)遲鈍，皮毛無光澤、發(fā)黃，食欲不振，體質(zhì)量下降、形體消瘦，出現(xiàn)咳嗽、喘息、聞及哮鳴音及痰鳴音等呼吸系統(tǒng)病癥；黃芪多糖各劑量組和潑尼松組大鼠精神狀態(tài)、呼吸、飲食等一般生存狀況均明顯改善，以黃芪多糖400 mg/kg組最為顯著。

2.2 各組大鼠肺組織整體肉眼觀察 肉眼觀察發(fā)現(xiàn)：正常對照組大鼠肺組織體積正常、呈淡紅色、表面光滑、彈性好；模型組大鼠肺組織體積明顯增大、呈暗紫紅色、表面粗糙、邊緣變鈍，彈性降低；較模型組，黃芪多糖各劑量組和潑尼松組大鼠肺臟組織整體狀況明顯好轉(zhuǎn)，以黃芪多糖400mg/kg組最為顯著。

2.3 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變觀察結(jié)果 見圖2。經(jīng)HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠肺組織肺小葉結(jié)構(gòu)正常，未見明顯細(xì)胞變性、壞死和脫落，無充血、水腫，間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常、出現(xiàn)明顯的細(xì)胞變性、壞死和脫落，部分肺泡明顯擴(kuò)大，肺泡壁出現(xiàn)斷裂，間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤；較模型組，黃芪多糖各劑量組和潑尼松組大鼠肺臟組織病變明顯好轉(zhuǎn)，以黃芪多糖400 mg/kg組最為顯著。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變（HE染色，400倍）

2.4 各組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子含量比較 見表1。與正常對照組相比，模型組大鼠血清中IL-8、TNF-α含量顯著升高而IL-10、IFN-γ含量顯著降低 （P<0.01）；與模型組比較，黃芪多糖 200、400 mg/kg組和潑尼松6 mg/kg組大鼠血清中IL-8、TNF-α含量顯著降低且IL-10、IFN-γ含量顯著升高 （P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子含量比較（ng/L，±s）

表1 各組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子含量比較（ng/L，±s）

與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別 n正常對照組 10模型組 10黃芪多糖100 mg/kg組 10 IL-8 IL-10 TNF-α IFN-γ 231.70±17.94 21.35±2.31 47.28±3.85 7.85±1.94 441.58±30.76** 10.96±1.84** 115.06±5.84** 3.97±1.26**422.73±31.08 12.61±1.95 107.34±6.13 4.15±1.35黃芪多糖 200 mg/kg組 10 385.19±27.95△ 15.28±2.27△ 86.82±5.20△ 4.76±1.60△黃芪多糖 400 mg/kg組 10 346.15±23.47△△ 17.72±2.40△△ 68.95±4.52△△ 5.03±1.58△潑尼松 6 mg/kg組 10 372.93±25.19△ 14.98±2.06△ 79.16±4.81△ 5.84±1.62△△

2.5 各組大鼠肺組織炎癥細(xì)胞因子含量比較 見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織IL-8、TNF-α含量顯著升高而IL-10、IFN-γ含量顯著降低 （P<0.01）；與模型組比較，黃芪多糖 200、400 mg/kg組和潑尼松6 mg/kg組大鼠肺組織IL-8、TNF-α含量顯著降低且IL-10、IFN-γ含量顯著升高 （P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠肺組織中炎癥細(xì)胞因子含量比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠肺組織中炎癥細(xì)胞因子含量比較（ng/L，±s）

組別 n正常對照組 10模型組 10黃芪多糖100 mg/kg組 10 IL-8 IL-10 TNF-α IFN-γ 376.49±8.25 26.18±3.46 150.32±10.25 13.72±2.03 469.17±13.62** 14.27±2.78**231.76±16.08** 5.93±1.31**451.36±14.15 15.80±2.96 220.81±15.90 6.28±1.46黃芪多糖 200 mg/kg組 10 435.19±12.03△ 18.19±3.17△ 197.62±13.35△ 7.36±1.75△黃芪多糖 400 mg/kg組 10 416.37±10.28△△ 21.69±3.12△△ 174.38±12.45△△ 9.27±2.16△△潑尼松 6 mg/kg組 10 427.86±11.17△△ 18.42±2.65△ 194.75±12.93△ 10.41±1.93△

2.6 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 見表3。與正常對照組比較，模型組大鼠VE、PEP、FEV1及 FEV1/PEP均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，黃芪多糖200、400 mg/kg組和潑尼松6 mg/kg組大鼠VE、PEP、FEV1及 FEV1/PEP比值均不同程度升高 （P<0.05 或P<0.01）。

表3 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較（±s）

組 別 n正常對照組 10模型組 10黃芪多糖100 mg/kg組 10 VE（L） PEP（L） FEV1（L） FEV1/PEP 195.83±25.18 33.06±1.94 8.42±0.25 0.25±0.08 117.34±27.51** 22.47±1.85** 4.13±0.49** 0.18±0.06*130.28±29.16 23.04±2.17 4.77±0.45 0.20±0.09黃芪多糖 200 mg/kg組 10 148.05±28.35△ 26.39±2.11△ 5.68±0.57△ 0.22±0.05△黃芪多糖 400 mg/kg組 10 156.37±32.49△ 28.45±2.08△△ 7.04±0.65△△ 0.24±0.09△潑尼松 6 mg/kg組 10 164.24±29.62△△ 30.19±2.20△△ 7.83±0.57△△ 0.26±0.08△

2.7 各組大鼠血氣分析結(jié)果比較 見表4。與正常對照組比較，模型組大鼠PaO2、pH顯著降低且PaCO2顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，黃芪多糖200、400 mg/kg 組和潑尼松 6 mg/kg 組大鼠 PaO2、pH顯著升高且PaCO2顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表4 各組大鼠血氣分析結(jié)果比較（±s）

表4 各組大鼠血氣分析結(jié)果比較（±s）

組 別 n正常對照組 10模型組 10黃芪多糖100 mg/kg組 10 PaO2（mmHg）PaCO2（mmHg） pH 83.02±2.97 51.27±2.35 7.35±0.2 51.24±3.05** 60.85±3.47** 7.19±0.06**58.41±3.75 58.12±3.60 7.21±0.06黃芪多糖 200 mg/kg組 10 66.05±3.98△ 54.78±3.13△ 7.29±0.05△黃芪多糖 400 mg/kg組 10 78.46±4.15△△ 53.61±3.19△ 7.31±0.07△潑尼松 6 mg/kg組 10 65.38±4.37△ 55.90±2.75△ 7.27±0.05△

3 討 論

COPD是以氣流受限、肺部炎癥伴隨肺功能降低為主要特征。COPD的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，但由于早期癥狀輕微，患者就診意識較差，導(dǎo)致COPD早期診斷率低于發(fā)病率［6］。COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍具有較高的病死率，也是臨床上亟待解決的難題之一。氣管內(nèi)滴注脂多糖加煙熏制備的COPD大鼠模型與臨床COPD患者病理機(jī)制近似［4］，是動物實驗研究中常用的造模方法。

黃芪首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是豆科植物黃芪的干燥根，味甘，性微溫，具有益氣補虛之功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖（APS）是其主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物學(xué)作用［2，7-8］。本研究通過氣管內(nèi)滴注脂多糖加煙熏的制備COPD大鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪多糖200～400 mg/kg治療能夠明顯改善COPD大鼠精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量及呼吸功能等一般生存狀態(tài)；能夠明顯改善COPD大鼠肺組織整體狀態(tài)，使其體積、色澤、表面光滑度及彈性等均明顯改善；能夠明顯改善COPD大鼠肺組織肺小葉、肺間質(zhì)、肺表面細(xì)胞等病理性改變，炎性細(xì)胞浸潤狀況明顯改善；提示黃芪多糖對COPD大鼠具有一定的保護(hù)作用。

VE、PEP、FEV1以及FEV1/PEP是監(jiān)測肺功能的常用指標(biāo)。COPD將導(dǎo)致進(jìn)入肺部的有效氣體量減少，從而導(dǎo)致機(jī)體處于一種相對缺氧狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)動脈血氧分壓降低、CO2分壓升高以及低氧血癥等一系列并發(fā)癥［9］，所以血氣分析指標(biāo)（PaO2、PaCO2、pH）也能夠間接反應(yīng)機(jī)體肺功能。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪多糖200～400 mg/kg 治療能夠明顯提高 VE、PEP、FEV1 及FEV1/PEP比值，明顯提高PaO2、PH并降低PaCO2，提示黃芪多糖具有改善COPD大鼠肺功能的作用。

炎癥細(xì)胞因子IL-8、TNF-α在COPD炎癥進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用［10］，Kim V 等［11］研究也認(rèn)為 IL-8、IL-10、TNF-α是肺部炎癥及COPD病理變化的重要生物標(biāo)記物。其中IL-8、TNF-α是COPD氣道炎癥反應(yīng)中構(gòu)成炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，能反映氣道炎癥的改變程度，在COPD的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用［12］，而 IL-10 具有抑制炎癥反應(yīng)的生理學(xué)作用［13］。IFN-γ是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的小分子多肽，IFN-γ能夠通過刺激巨噬細(xì)胞而激活中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡，從而參與COPD氣道炎癥的形成［14-15］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪多糖200～400 mg/kg治療能夠明顯降低COPD大鼠肺組織 IL-8、TNF-α 含量并提高 IL-10、IFN-γ 含量，提示黃芪多糖具有抑制COPD大鼠炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，黃芪多糖具有抑制COPD大鼠肺組織損傷并改善肺功能的作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。