劉福生 方曉磊 袁斯遠 鄭香春 劉 錦

王瀟慧2 孫江燕2 王 秋2 吳 婧2 王蘇妹1△

（1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

膿毒癥（Sepsis）是指由感染引起的宿主反應失調導致的器官功能障礙；膿毒癥和膿毒癥休克是多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要原因［1］。膿毒癥屬于本虛標實證，扶正祛邪是治療膿毒癥的重要治法。早期扶正與祛邪并舉的治療方案有助于降低膿毒癥患者的病死率［2］。通里攻下法的代表藥大黃是治療膿毒癥最早、最多的單味中藥之一［3］，大黃類制劑可以降低膿毒癥患者的死亡率［4］。大黃附子湯出自《金匱要略》，是溫下劑的代表方，由大黃、附子、細辛3味藥物組成，全方既有大黃通里攻下以祛邪，又有附子、細辛溫里散寒以扶正，寒溫并用，切合膿毒癥本虛標實的病機。本研究采用大黃附子湯加味對膿毒癥大鼠干預，觀察溫下法對膿毒癥大鼠小腸運動及腸黏膜通透性的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

48只SPF級Wistar雄性大鼠購于北京維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：（京）2016-0011。體質量200～240 g，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物房。所有動物飼養(yǎng)在（60±5）%濕度、（20±2）℃溫度及 12 h 光照/12 h黑暗交替周期環(huán)境中。

1.2 藥物及試劑

大黃附子湯加味（組成：生大黃9 g，炮附子15 g，細辛3 g，僵蠶 6 g，蟬蛻 3 g，姜黃 6 g）顆粒劑購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。枸櫞酸莫沙必利 （國藥準字H19990317，購自魯南貝特制藥有限公司）。離心機，微量移液器及酶標儀（Thermo Scientific，USA），顯微鏡（OLYMPUS U-CMAD-2），圖像采集系統(tǒng)（Nikon DSFi2）。 大鼠胃泌素（GAS）、胃動素（MTL）、D-乳酸及PCT檢測試劑盒購自北京百奧思科生物醫(yī)學技術有限公司，移液器吸頭（10 μL及200uL），凍存管及采血管購自北京泰科美生物科技有限公司。

1.3 造模及分組

48只SPF級Wistar大鼠隨機分為正常對照組10只，其余38只大鼠采用盲腸結扎穿孔法復制大鼠膿毒癥模型［5］，方法如下：術前禁食 12 h，10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉，備皮、碘伏消毒腹部，取下腹正中切口2 cm入腹以暴露盲腸。在盲腸遠端1/2處用無菌4號絲線緊緊結扎，用無菌中號圓針帶7號絲線縫穿結扎盲腸遠端，并將7號絲線雙股打結，留約直徑2 cm的線環(huán)。用1 mL注射器向已結扎盲腸遠端注射0.9%氯化鈉注射液0.5 mL，分2層關腹，制成膿毒癥大鼠模型。造模成功的36只大鼠隨機分為模型對照組、中藥組與西藥組，各12只。

1.4 干預方法

造模成功后各組大鼠均禁食不禁水飼養(yǎng)，中藥組大鼠予大黃附子湯加味中藥（4 mg/kg）灌胃，每24小時2次。西藥組給予枸櫞酸莫沙必利（1.5 mg/kg）灌胃，每24小時2次。正常對照組和模型對照組予等量滅菌注射用水灌胃。各組觀察時間為24 h。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 各組大鼠小腸組織病理觀察 造模后24 h后將12%碳末混懸液0.2 mL/10 g灌胃。20 min后4%水合氯醛麻醉后取材。主動脈取全血，離心后分裝-80℃以待測定；分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部的腸管；剪取距盲腸根部小腸2 cm，解開腸管，使用PBS沖洗干凈腸內(nèi)容物后放入10%甲醛溶液固定，24 h后石蠟切片做HE染色觀察大鼠小腸組織病理。

1.5.2 小腸碳末推進百分率測定 取材前將12%碳末混懸液0.2 mL/10 g灌胃。20 min后處死動物。剖開腹腔，分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部的腸管。輕輕將腸管拉直，準確量取幽門至碳末推進前沿的長度以及小腸總長度。按照公式計算：（從幽門部到碳末推進前沿的推進距離/大鼠小腸總長）×100%計算小腸碳末推進百分率。

1.5.3 大鼠血清降鈣素原（PCT）測定 采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法免疫發(fā)光法（ELISA）檢測。根據(jù)本實驗確立的膿毒癥判斷指標和標準確定大鼠膿毒癥模型制作成功，根據(jù)統(tǒng)計學原理算出占正常大鼠95%的血清PCT的正常值；造模后血清PCT高于正常值2個及以上標準差為膿毒癥造模成功的判斷標準。根據(jù)該模型約術后12 h開始出現(xiàn)膿毒癥表現(xiàn)，72 h死亡率約75%～85%。

1.5.4 大鼠D-乳酸、GAS及MTL的含量測定 釆用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）在多功能酶標儀中測量待檢樣品的吸光值（A），按照試劑盒說明的各項步驟進行檢測。根據(jù)酶標儀檢測的吸光值，利用標準曲線的二次方程式計算得出待檢樣品中D-乳酸GAS及MTL的含量（pg/mL）。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布組間比較采用單因素方差檢驗，計數(shù)資料采用率表示，組間對比比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠死亡率比較

造模后24 h后正常對照組大鼠無死亡；模型對照組與西藥組大鼠死亡4只，死亡率33.33%；中藥組大鼠死亡2只，死亡率16.67%，低于模型組和西藥組（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠小腸黏膜病理改變

見圖1，圖2。光學顯微鏡下假手術組大鼠各時間點小腸黏膜組織結構完整，腸絨毛排列整齊，清晰可見漿膜層、肌層、固有層以及黏膜層，甚至可見黏液層。模型對照組、中藥組和西藥組大鼠小腸黏膜厚度明顯變薄，腸絨毛排列不整齊，部分區(qū)域有絨毛上皮剝離，局部可見固有層崩解，絨毛增粗縮短，可見局部炎癥細胞浸潤。與西藥組和模型組對比，中藥組大鼠小腸黏膜厚度稍增厚，局部炎癥細胞浸潤減少。

圖1 各組大鼠小腸黏膜病理改變 （HE染色，100倍）

圖2 各組大鼠小腸黏膜病理改變 （HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠小腸黏膜損傷指數(shù)、D-乳酸及PCT含量比較

見表1。與正常對照組比較，中藥組、西藥組與模型對照組小腸黏膜損傷指數(shù)、D-乳酸及PCT水平均增高（P＜0.05）；與模型對照組比較，西藥組小腸黏膜損傷指數(shù)、D-乳酸及PCT水平差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；與模型對照組和西藥組比較，中藥組小腸黏膜損傷指數(shù)、D-乳酸及PCT水平均降低（P＜0.05）。

表1 各組小腸黏膜損傷指數(shù)、D-乳酸及PCT含量比較（±s）

表1 各組小腸黏膜損傷指數(shù)、D-乳酸及PCT含量比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05。 下同

組 別 n 小腸黏膜損傷指數(shù)評分（分）D-乳酸（μg/mL）PCT（μg/L）正常對照組 10 0.38±0.02模型對照組 8 1.05±0.08*西藥組 8 0.99±0.12*0.27±0.34 7.70±1.41 4.25±0.62* 11.16±0.75*3.41±0.46* 10.43±0.45*中藥組 10 0.82±0.08*△▲1.92±0.59*△▲ 8.90±0.64*△▲

2.4 各組大鼠小腸傳輸率、MTL及GAS比較

見表2。與正常對照組比較，中藥組、西藥組及模型對照組小腸傳輸率、MTL及GAS均明顯減低（P＜0.05）；與模型對照組比較，中藥組和西藥組小腸傳輸率、MTL及GAS均明顯升高（P＜0.05）；小腸傳輸率、MTL及GAS在中藥組和西藥組之間無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠小腸傳輸率、MTL及GAS比較（±s）

表2 各組大鼠小腸傳輸率、MTL及GAS比較（±s）

組 別 n GAS（pg/mL）小腸傳輸率（%） MTL（pg/mL）正常對照組 10 147.64±37.96模型對照組 8 57.14±3.75*西藥組 8 67.51±2.48*△71.00±10.00 40.54±22.67 22.00±8.00* 18.53±1.22*40.00±9.00*△ 33.56±1.52*△中藥組 10 66.88±2.63*△45.00±14.00*△ 32.11±2.22*△

3 討 論

膿毒癥的致病機制十分復雜，涉及病原微生物、宿主炎癥反應失衡、免疫功能紊亂、腸道微生態(tài)、凝血異常以及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡、線粒體損傷、內(nèi)質網(wǎng)應激、細胞自噬、基因多態(tài)性等多方面病理生理變化［6］。胃腸功能紊亂已成為判斷MODS患者預后的一個重要條件，日益引起研究者的重視［7-8］。由于炎癥介質大量釋放，膿毒癥患者毛細血管滲漏及血管舒縮障礙都會累及胃腸功能。當胃腸功能受到損傷后，影響腸道菌群及其產(chǎn)物的吸收和調控功能，進而影響胃腸腸道黏膜屏障、免疫功能及內(nèi)分泌功能，同時腸道作為體內(nèi)最大的“儲菌庫”和“內(nèi)毒素庫”，其黏膜功能受損導致細菌移位，進一步加重膿毒癥的進展［9］。目前膿毒癥的治療強調集束化治療，目前中醫(yī)藥治療膿毒癥治法有清熱解毒法、通里攻下法、活血化瘀法與扶正固本法［10］。膿毒癥屬于本虛標實證，合并腸功能障礙的膿毒癥患者的中醫(yī)證型分布以虛證和虛實夾雜證占有更大比例［11］，大量使用抗生素的情況下往往存在正氣不足，若單純輔助正氣容易助邪、單用驅邪容易傷及正氣，不利于疾病轉歸?；谝陨喜C及困境，大黃附子湯加減為代表的溫下法治療危重癥胃腸功能障礙具有較好的療效［12］，能改善膿毒癥患者炎癥狀態(tài)和胃腸功能障礙、降低死亡率［13-14］。

為觀察溫下法治療膿毒癥的療效并探討其機制，本研究以CLP誘導膿毒癥大鼠為載體，觀察大黃附子湯加味對膿毒癥大鼠小腸運動及腸黏膜通透性的影響?；谠u價大黃附子湯加味對膿毒癥大鼠小腸運動及腸黏膜通透性，因此選用臨床常用胃動力藥枸櫞酸莫沙必利作為陽性對照［15］。D-乳酸主要來源于胃腸道細菌的酵解，在重癥感染患者早期即存在升高，且可預測感染性休克的發(fā)生［16］，感染、缺血和創(chuàng)傷性休克都能導致血中D-乳酸濃度的升高［17］。當嚴重感染、休克、Sepsis及MODS時，PCT在血漿中的表達水平升高。小腸傳輸率可以反應腸運動。GAS短期作用是刺激胃酸的分泌，長期作用是促進胃點膜增生，促進胃腸道分泌和運動，增強胃腸和膽囊收縮功能等。MTL具有刺激上消化道機械運動和生理機電活動，加強結腸運動和膽囊收縮等作用。危重癥患兒血液GAS、MTL等水平與病情危重程度有關，病情越重GAS和MTL水平越高［18］。本研究綜合病死率、小腸黏膜損傷程度、D-乳酸、PCT、小腸傳輸率、MTL及GAS作為評價大黃附子湯加味治療膿毒癥的療效和機制指標。

本研究大黃附子湯加味由大黃附子湯聯(lián)合升降散，大黃附子湯出自《金匱要略》，是溫下劑的代表方；升降散升清降濁、散風清熱，治溫病表里三焦大熱。由生大黃、炮附子、細辛、僵蠶、蟬蛻、姜黃組成。大黃清熱通腑、活血解毒，附子溫陽祛寒，大黃藉附子之大熱，其寒性去而走瀉之性得存，具有通腑活血解毒功效；細辛辛散溫通，可宣通陽氣，僵蠶清熱解郁，善能升清散火；蟬蛻清熱解表，宣毒透達；姜黃辛苦性寒，善能行氣活血解郁，散肌表之毒邪。全方祛邪扶正，升降同調，寒溫并用，切合膿毒癥本虛標實的病機。結果顯示，與模型組對比，大黃附子湯加味可以降低膿毒癥大鼠的死亡率、小腸黏膜損傷程度、D-乳酸、PCT，改善小腸傳輸率、MTL及GAS，提示大黃附子湯加味可能通過促進腸道運動、改善腸黏膜損傷及通透性從而調節(jié)炎癥狀態(tài)發(fā)揮治療膿毒癥的作用。與西藥組對比，大黃附子湯加味可以降低膿毒癥大鼠的死亡率、小腸黏膜損傷程度、D-乳酸和PCT水平，在改善小腸傳輸率、MTL及GAS組間無明顯差異，提示大黃附子湯加味具有莫沙比利改善胃腸運動的作用，還能改善腸黏膜損傷及通透性，這與研究表明大黃附子湯可減輕失血性休克復蘇后腸道黏膜屏障損傷［19］及改善胰腺炎患者機體炎癥狀態(tài)［20］結果具有類似之處。

綜上所述，大黃附子湯加味可促進腸道運動，改善腸黏膜通透性，調節(jié)肌體炎癥狀態(tài)，降低死亡率，發(fā)揮治療膿毒癥的作用。大黃附子湯是溫下法的代表方，因此溫下法可能通過調節(jié)腸道運動和腸黏膜通透性調節(jié)炎癥狀態(tài)發(fā)揮治療膿毒癥的作用，為溫下法治療膿毒癥（陽虛腑實證）提供一定的依據(jù)。