馬玉姍 刁敏 林雪梅 屈藝 李浩 柳慧

( 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 1.麻醉科；2. 出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3. 四川大學(xué)華西醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610041)

促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, EPO)是一種多效性細(xì)胞因子，其主要活性是通過(guò)抑制骨髓中紅系祖細(xì)胞的凋亡而達(dá)到促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用[1]。利用重組DNA技術(shù)人工合成的重組人促紅細(xì)胞生成素(Recombiant Human Erythropoietin, rhEPO)已廣泛用于臨床治療包括癌癥[2]、早產(chǎn)[3]及慢性腎病[4]等多種原因引起的貧血。EPO除了具有造血活性外，還具有廣泛的組織保護(hù)活性，尤其是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在胎鼠宮內(nèi)缺氧缺血模型中，EPO能夠很好地通過(guò)胎盤(pán)和血腦屏障，對(duì)胎鼠宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[5-6]。然而EPO發(fā)揮組織保護(hù)作用的劑量(1000U/Kg )遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于促進(jìn)紅細(xì)胞生成的劑量(50-100U/Kg )[7-9]。大劑量或長(zhǎng)期使用EPO可造成對(duì)骨髓造血系統(tǒng)的過(guò)度刺激，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞增多癥、高血壓及血栓形成等不良反應(yīng)[10]。尤其是妊娠期婦女血液處于高凝狀態(tài)[11]，EPO的使用不可避免地會(huì)導(dǎo)致圍產(chǎn)期發(fā)生血栓性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，這就限制了EPO在產(chǎn)科的進(jìn)一步應(yīng)用。

氨甲酰化促紅細(xì)胞生成素 (Carbamylated Erythropoietin, CEPO) 是EPO的衍生物。在EPO中加入氰酸鹽，將EPO中的賴氨酸殘基變成高瓜氨酸殘基，使其喪失促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用[10]，卻保留了組織保護(hù)作用。CEPO功能上的優(yōu)勢(shì)使其在組織保護(hù)方面具有取代EPO的趨勢(shì)，并已進(jìn)入二期臨床研究階段[12]。目前有關(guān)EPO作用于孕鼠的研究較少，罕見(jiàn)關(guān)于EPO或CEPO對(duì)孕鼠血液流變學(xué)影響的相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過(guò)孕鼠腹腔給予大劑量EPO和CEPO，觀察孕鼠紅細(xì)胞生成及血液粘滯度相關(guān)指標(biāo)的變化，明確EPO和CEPO對(duì)孕鼠血液流變學(xué)的影響，為將來(lái)應(yīng)用于產(chǎn)科臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料 EPO(成都地奧集團(tuán))，氰酸鉀(Sigma 公司)，硼酸鈉(成都市科龍化工試劑廠)，戊巴比妥鈉，醫(yī)用石蠟、中性樹(shù)膠(上海懿洋)，伊紅(Merck)，蘇木精(Amresco)，TO透明劑(上海源葉)，超濾管(Millipore)，透析袋(Viskase)，真空采血管(美國(guó) BD)，靜脈留置針(泰爾茂日本)，XE-2100全自動(dòng)血液分析儀，SA-6000全自動(dòng)血液流變儀(北京賽科希德)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 育齡期無(wú)交配史SD大鼠購(gòu)至成都達(dá)碩動(dòng)物有限公司, 體重240～260g。孕鼠以繁殖顆粒飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫22℃，相對(duì)濕度85 %。

1.3 CEPO制備 根據(jù)Leist等[13]的方法制備CEPO。0.5mg(1mg/ml) EPO 與0.5ml 1mol/L 硼酸鈉(PH 8.8)和81.11mg氰酸鉀(KOCN 分子量81.11)混勻, 使KOCN最終濃度為1mol/L, 放入37℃恒溫水浴儀，溫浴23h后移至透析袋中, 夾緊袋口, 在1000ml Milli-Q water中4℃透析過(guò)夜。再放入1000ml 20 mmol/L 檸檬酸鈉0.1 mol/L NaCl (PH 6.0)中4℃透析過(guò)夜。再置于0.02mol/L檸檬酸鈉1000ml及0.1mol/L NaCl(pH6.0)中4℃過(guò)夜。獲得的CEPO采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定濃度。

1.4 確定妊娠 將發(fā)情期且既往無(wú)交配史的雌、雄SD大鼠按2:1比例合籠。從次日晨起用棉簽作陰道涂片，在顯微鏡下查看分泌物中是否含有精子, 并檢查籠中是否有陰道栓。如發(fā)現(xiàn)有其中一項(xiàng)即初步判斷為受孕，并將當(dāng)日定為受孕第1天, 提出單籠飼養(yǎng)至孕17天。記錄每日體重增加情況，并作為是否懷孕的另一依據(jù)。如期間體重不隨受孕天數(shù)增長(zhǎng)，則排除受孕。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及方法 將15只孕17天SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(NS組)、EPO處理組( EPO組)及CEPO處理組(CEPO組)，每組5只。各組分別經(jīng)腹腔注射0.9%NS (1mL/次)、EPO(5000 U /Kg)及CEPO(50 μg/Kg)，連續(xù)3天。其中，EPO及CEPO用0.9% NS稀釋至1ml。給藥未滿4天的孕鼠如發(fā)生自然分娩，則不納入實(shí)驗(yàn)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo) 連續(xù)給藥3天，于第4天將孕鼠用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg腹腔內(nèi)注射)麻醉后經(jīng)下腔靜脈采血，檢測(cè)紅細(xì)胞生成相關(guān)指標(biāo)：網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(Reticulocyte Count, RET#)、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比(RET%)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(Red Blood Cell, RBC)及血紅蛋白(Hemoglobin, HGB)等，以及血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)：低切變率1全血粘度、低切變率5全血粘度、中切變率50全血粘度及高切變率200全血粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)(Erythrocyte Aggregation Index, EAI)及紅細(xì)胞壓積(Hematocrit, HCT)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，多組間比較使用單因素方差分析(ANOVA)，若方差齊性，則兩兩比較使用LSD法；若方差不齊，則兩兩比較使用Dunnett's T3法。采用Pearson相關(guān)分析對(duì)計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞生成相關(guān)指標(biāo)的比較

2.1.1 EPO導(dǎo)致孕鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值及百分比(RET#及RET%)升高，且主要引起幼稚RET比例的增加，提示EPO能刺激孕鼠骨髓的造血功能 EPO組的RET#及RET %均高于NS組及CEPO組(P<0.05)，NS組及CEPO組組間比較無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1～2。

圖1 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5,000 U/Kg) 對(duì) RET#的影響

Figure1EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onRET#

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

圖2 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對(duì)RET%的影響

Figure2EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onRET%

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

本研究的結(jié)果顯示：MFR%各組間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；EPO組的IRF及HFR%均高于NS組及CEPO組(P<0.05)，而LFR%低于NS組及CEPO組(P<0.05)；CEPO組的IRF、LFR%、MFR%及HFR%與NS組比較均無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖3。以上結(jié)果提示EPO 組幼稚RET增加，骨髓造血功能活躍。

圖3 CEPO (50 μg/Kg)及EPO (5000 U/Kg) 對(duì)RET分類的影響

Figure3EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onRETclassification

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

2.1.2 EPO導(dǎo)致孕鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)及血紅蛋白(HGB)升高 EPO組的RBC及HGB均高于NS組及CEPO組(P<0.05)，NS組及CEPO組組間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖4、5。提示EPO組外周血中紅細(xì)胞生成增加。

2.2 血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較顯示：EPO導(dǎo)致全血粘滯度升高的風(fēng)險(xiǎn)增加

2.2.1 EPO導(dǎo)致孕鼠全血粘滯度增加 低切變率全血粘度能反映紅細(xì)胞的聚集性。低切變率全血粘度越高，紅細(xì)胞聚集性越高。EPO 組低切變率1(1/s)全血粘度、低切變率5(1/s)全血粘度及中切變率50(1/s)全血粘度均高于NS組及CEPO 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； NS組與CEPO 組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組間高切變率200(1/s)全血粘度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖6。EPO組的紅細(xì)胞聚集指數(shù)(EAI)高于NS組和CEPO組，但各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

圖4 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對(duì) RBC的影響

Figure4EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5,000U/Kg)onRBC

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

圖5 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對(duì)HGB的影響

Figure5EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onHGB

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

圖6 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對(duì)全血粘度的影響

Figure6EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onbloodviscosity

注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

2.2.2 EPO導(dǎo)致紅細(xì)胞壓積(HCT)的增加 HCT是反映血液濃度的指標(biāo)，在影響血液粘度的諸因素中，HCT對(duì)不同切變率下的全血粘度影響最大。EPO組的HCT高于NS組及CEPO組(P<0.05)，其余各組間比較無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖8。

圖7 CEPO (50 μg/Kg) 及EPO (5000 U/Kg) 對(duì)EAI的影響

Figure7EffectsofCEPO(50μg/Kg)andEPO(5000U/Kg)onErythrocyteAggregationIndex

圖8 CEPO (50 μg/Kg)及EPO (5000 U/Kg) 對(duì) HCT的影響Figure 8 Effects of CEPO (50 μg/Kg) and EPO (5000 U/Kg) on HCT注：與NS組，①P<0.05；與EPO組，②P<0.05

2.3 部分檢測(cè)指標(biāo)間相關(guān)性分析 紅細(xì)胞壓積(HCT)與RBC、HGB、RET # 呈正相關(guān)關(guān)系，即RBC、HGB、RET # 數(shù)值越多，HCT越高。切變率1(1/s)、5(1/s)全血粘度與紅細(xì)胞聚集指數(shù)(EAI)成正相關(guān)，即切變率1(1/s)、5(1/s)全血粘度越高，EAI越高，見(jiàn)表1。

表1 參數(shù)相關(guān)分析Table1 Analysis of correlations among some parameters

3 討論

網(wǎng)織紅細(xì)胞根據(jù)RNA含量的多少分為低熒光網(wǎng)織紅細(xì)胞(Low Fluorescence Reticulocyte, LFR，成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞)、中熒光網(wǎng)織紅細(xì)胞(Middle Fluorescence Reticulocyte, MFR，中間網(wǎng)織紅細(xì)胞)和高熒光網(wǎng)織紅細(xì)胞(High Fluorescence Reticulocyte, HFR，未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞)。熒光強(qiáng)度越高，提示網(wǎng)織紅細(xì)胞含RNA越多，細(xì)胞也就越幼稚；反之，熒光強(qiáng)度越低，表示網(wǎng)織紅細(xì)胞含RNA越少，細(xì)胞也就越成熟。因此，MFR和HFR比RET更早反映紅細(xì)胞生成的開(kāi)始。未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞指數(shù)(Immature Reticulocyte Fraction, IRF )為MFR%與HFR%之和，反應(yīng)了幼稚RET占總RET的百分比[14]，能更早、更靈敏地反應(yīng)骨髓造血功能的開(kāi)始，是評(píng)價(jià)抗貧血藥物療效的敏感指標(biāo)。

造血功能增加時(shí)，網(wǎng)織紅細(xì)胞發(fā)生變化的順序?yàn)镸FR、HFR、IRF及RET#[15]，其中HFR的增加反應(yīng)了紅細(xì)胞生成的開(kāi)始，HFR對(duì)EPO功能而言比RET#更實(shí)用[16]。本研究說(shuō)明EPO會(huì)刺激骨髓造血功能，使大量不成熟RET從骨髓釋放到外周血中，導(dǎo)致HFR、IRF及RET的增高。有研究報(bào)道，給與小鼠連續(xù)3天皮下注射EPO后48小時(shí)會(huì)導(dǎo)致RBC增加，和我們的結(jié)果相似[17]。 多項(xiàng)研究表明HCT、RBC及HGB的增加是導(dǎo)致血栓發(fā)生的危險(xiǎn)因素[18-21]。主要原因可能是紅細(xì)胞增加與凝血功能的增加有關(guān)：血紅蛋白過(guò)低的患者出血風(fēng)險(xiǎn)增加，但進(jìn)行輸血治療后能糾正出血；血小板減少的病人即使不輸血小板，只輸入紅細(xì)胞也會(huì)改善其凝血功能[22]。而凝血功能是血栓形成的三要素之一，凝血功能的增加會(huì)使血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加。除了凝血功能改變外，血流改變是血栓形成的三要素中的另一重要因素。血液流變學(xué)的異常可能導(dǎo)致血液粘滯度增加，血流緩慢，血管阻力增加，血流淤滯容易使凝血物質(zhì)聚集，導(dǎo)致血栓形成，是公認(rèn)的血栓性疾病的預(yù)見(jiàn)性指標(biāo)。

我們檢測(cè)了全血粘度、EAI及HCT等血液流變學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)給予EPO能導(dǎo)致血液低切變率1(1/s) 全血粘度、低切變率5(1/s) 全血粘度、中切變率50(1/s)全血粘度、EAI及HCT的增加，而CEPO則沒(méi)有該作用。全血粘度反映了血液在流動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的流動(dòng)摩擦力，主要影響因素有紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞的流變性(包括紅細(xì)胞聚集性和紅細(xì)胞變形性)以及切變率，其中低切變率全血粘度主要反映紅細(xì)胞聚集性，具有較大的意義。我們的結(jié)果顯示紅細(xì)胞聚集性增高和低切全血粘度增高呈正相關(guān)(r=0.958，P=0.000)，說(shuō)明低切變率下血流緩慢，血液粘滯度越高，紅細(xì)胞越容易聚集。因此紅細(xì)胞聚集性增高可能是導(dǎo)致低切變率下血液粘度增高的原因。

我們還發(fā)現(xiàn)注射EPO后會(huì)導(dǎo)致孕鼠HCT增加，而CEPO則沒(méi)有該作用。在影響血液粘度的多個(gè)因素中，HCT對(duì)不同切變率下的全血粘度影響最大[23]。血液粘度隨HCT的增加而增加，當(dāng)HCT 在25.32%到60.16%之間時(shí)，HCT增加10.99%會(huì)導(dǎo)致血液粘滯度增加20%，根據(jù)泊簫葉公式，粘滯度增加20%會(huì)減緩血流16.67%。生理上為了代償20%血液粘滯度增加，血壓會(huì)增加20%，或血管半徑會(huì)擴(kuò)張4.66%，當(dāng)冠心病患者血管擴(kuò)張受限時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致心肌缺血[24]。因此，EPO的藥品說(shuō)明書(shū)中的不良反應(yīng)防范中明確指出，用藥過(guò)程中需要監(jiān)測(cè)HCT，當(dāng)HCT高于40%，應(yīng)停用，當(dāng)下降到36%后，再繼續(xù)給予EPO，以免血栓的發(fā)生。而我們的結(jié)果表明，注射CEPO不會(huì)導(dǎo)致孕鼠HCT增加，即不會(huì)增加孕鼠血液粘滯度，不會(huì)增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，與EPO相比， CEPO不會(huì)促進(jìn)母鼠骨髓造血功能增加、紅細(xì)胞生成，不會(huì)改變低切全血粘度及HCT等血液流變學(xué)指標(biāo)，不會(huì)導(dǎo)致血液粘滯度的增加，具有更好的產(chǎn)科應(yīng)用前景。