龍曙萍，李騰達，劉 云，郭 杰，張薇薇，谷明莉，鄧安梅

(海軍軍醫(yī)大學長海醫(yī)院，上海 200433)

熱相關疾病(heat-related illness)是指機體暴露在高溫環(huán)境中而產生的一系列生理問題，導致身體核心溫度的升高且超過體溫正常代償范圍［1］。熱相關疾病包括輕微熱相關疾病(熱水腫、熱痙攣和熱暈厥等)和熱休克損傷(heat stroke，HS，也稱中暑)，其中熱休克損傷是最常見的熱相關疾?。?］，嚴重的熱休克損傷會導致酸中毒和細胞缺氧［3］。熱休克損傷包括勞力性中暑和經典型中暑，前者多由體力勞動誘導，多發(fā)于年輕的運動員和體力勞動者;后者多與氣候和濕度相關，多發(fā)于少兒和老人等體弱者［4］。熱習服(heat acclimatization，HA)定義為機體對核心溫度升高的生理和感知適應性，即高溫耐受性［5］。在熱習服過程中，基因和蛋白的表達會發(fā)生一系列變化［5］。

microRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，通常位于相應 mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，對編碼蛋白質的靶基因mRNA發(fā)揮抑制作用［6］。miR-193a編碼基因(mIR193a)位于染色體17q11.2，能夠抑制正常細胞的增殖和細胞周期［7］。miR-193a-3p在多種腫瘤中發(fā)揮著抑制腫瘤的作用。有研究表明，在急性白血病患者分離的造血干細胞中，miR-193a-3p與PTEN/PI3K信號通路協同作用并促進白血病發(fā)生［8］。在潰瘍性結腸癌患者中miR-193a-3p下調，并通過上調IL-17RD促進癌癥發(fā)生［9］。但目前未有miR-193a-3p在熱休克損傷方面的研究報道，而miR-193a-3p在熱損傷疾病中的變化和臨床意義也不明確，因此本實驗通過分析熱損傷/熱習服大鼠血清中miR-193a-3p的變化及其與相關炎癥因子的關系來探討其在熱相關疾病發(fā)病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象 實驗大鼠購買并飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，成年雄性SD大鼠，6～8周齡，200～250 g，個體間體重和肛溫基本一致。每日光照時間為7∶00～19∶00，大鼠自由進食和飲水。為減少環(huán)境變化對動物的影響，所有動物預先飼養(yǎng)一周，然后進行實驗。

1.2 試劑與儀器 體溫計，離心機(日本Hitachi)，PCR 儀(美國 Applied Biosystems)，ELISA 試劑盒(美國eBioscience)，酶標儀(美國Thermo Scientific)，Trizol(美國 invitrogen)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠熱損傷/熱習服模型的建立:45只實驗大鼠隨機分為3組:熱損傷(HS)組，熱習服(HA)組和對照(HC)組。HS組大鼠置于溫度(43±0.5)℃，濕度(70±5)%的智能模擬實驗艙中120 min，大鼠在實驗艙內自由活動，禁止飲水與進食，每隔10 min測定一次肛溫，肛溫＞42.5℃認為達到HS，記錄達到HS的時間。HA組大鼠置于溫度(34±0.5)%，濕度(70±1)℃的實驗艙中 30天，每天9∶00am測量大鼠肛溫，大鼠自由進食與飲水。HC組正常飼養(yǎng)。

1.3.2 采血與分離血清:大鼠稱重后，按照300 mg/kg為單位腹腔注射水合氯醛。麻醉后迅速進行心臟采血，3599 r/min離心5 min分離血清。取1 ml血清用于細胞因子和蛋白的檢測，剩下的加入Trizol用于提取RNA。

1.3.3 microRNA提取:反轉錄與qRT-PCR:按照Taqman microRNA Assays說明書檢測microRNA的表達水平。用反轉錄試劑盒將microRNA反轉為cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內參，設立平行對照組2組，重復組3組，于ROCHI 4800上進行qRT-PCR。熱休克蛋白 70(heat shock protein，HSP70)與細胞因子的檢測:按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中的熱休克蛋白70(HSP70)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α) 和轉化生長因子(transforming growth factor-β)的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析 數據符合正態(tài)分布采用均值±標準差(珋±s)的形式表示，不符合正態(tài)分布采用中位數和四分位間距來描述數據的集中趨勢和離散趨勢。實驗組與對照組之間的比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05表示兩變量之間差異具有統(tǒng)計學意義。以Pearson相關性分析來比較兩變量之間的相關性，檢驗水準 α為0.05。統(tǒng)計軟件為 IBM SPSS statistics21.0和 Graghpad Prism6.0。

2 實驗結果

2.1 microRNA-193a-3p在大鼠血清中的表達microRNA193a-3p在 HS，HA和 HC組中分別為0.99±0.30，1.13±0.33 和 2.15±0.35。microRNA-193a-3p在HA和HS組中的表達與對照組相比顯著降低且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 大鼠血清HSP70及相關細胞因子的表達見表1。HS組、HA組與HC組的HSP70和細胞因子的比較采用 Dunnett-t檢驗，HSP70，IL-1β，TGF-β和TNF-α在HS組中的表達與HC組相比顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，HSP70，IL-1β 和TNF-α在HA組中的表達與HC組相比顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 大鼠血清中HSP70及相關細胞因子的表達情況(珋±s)

表1 大鼠血清中HSP70及相關細胞因子的表達情況(珋±s)

項 目 HS HA HC P HS vs HC HA vs HC HSP70(pg/ml)IL-1β(ng/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β(pg/ml)617.19±21.6254.29±5.60208.14±11.33119.56±17.39361.19±26.3031.19±3.57111.44±9.4685.76±9.32327.21±28.4924.73±3.3993.34±4.2092.30±8.94＜0.001＜0.001＜0.001＜0.0010.001＜0.001＜0.0010.27

2.3 HS組，HA組microRNA-193a-3p與HSP70和細胞因子的相關性分析 見表2。在HS組中，microRNA-193a-3p與 HSP70，IL-1β 和 TNF-α 呈顯著負相關(r=－0.821，－0.839，－0.578，均P＜0.05)。在HA組中，microRNA-193a-3p與HSP70，IL-1β 呈顯著負相關(t=－0．770．－0．766，均P＜0.05)。

表2 HS組，HA組microRNA-193a-3p與HSP70和細胞因子的相關性分析

3 討論隨著全球極端天氣出現的次數增多，熱損傷疾病的發(fā)病率和死亡率增加。熱休克是一種對高溫的系統(tǒng)性炎癥反應，循環(huán)衰竭導致多器官衰竭和中樞神經系統(tǒng)功能紊亂。當機體體溫升高到一定程度時，細胞的代謝產物增多且循環(huán)衰竭，導致體內有害物質堆積、組織功能紊亂和損傷［4］。此外，從腸系膜漏出的內毒素增多，而熱損傷導致肝細胞功能受損并且肝靜脈血流減少，因此增加的內毒素不能在肝內很好的失活并解毒，繼發(fā)內毒素血癥，并誘導機體產生多種細胞因子。而產生的炎性細胞因子又進一步導致低血壓、循環(huán)衰竭和核心體溫增加［4］，如此周而復始，惡性循環(huán)。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是首次在遭受熱應激的果蠅中發(fā)現的進化高度保守的基因，熱休克蛋白是一組催化新生蛋白和變性蛋白正確再折疊的分子伴侶［11］。HSP70是研究最多的與熱損傷相關的熱休克蛋白［11］。新生的HSP70在高溫下熱力學穩(wěn)定并迅速執(zhí)行分子伴侶的功能，盡量減少熱休克反應和損傷［12］。Pre-miRNA-193a(miRNA-193a 前體)產生兩種成熟的 miRNA:miRNA-193a-3p和miRNA-193a-5p。miRNA-193a-3p是腫瘤抑制miRNA，通過作用于靶基因對腫瘤的增殖、凋亡、轉移和侵襲發(fā)揮重要作用［7］。在急性白血病中，miRNA-193a-3p下調促進融合蛋白AML-ETO的致瘤性，因為miRNA-193a-3p抑制很多靶基因如:AML1/ETO，DNMT3a，HDAC3，KIT，CCND1 和MDM2的表達［8］。在潰瘍性結腸炎病活動期，miRNA-193a-3p作為PepT1的靶基因通過減少PepT1的表達而抑制NF-κB信號通路，因此阻斷腸道微生物產物誘導的腸道固有免疫反應［10］。在寄生蟲誘導的感染免疫小鼠模型中，編碼IL-1β，TNF-α，IFN-γ和 NF-κB的 mRNA表達上調，而 miRNA-193a-3p表達下調［13］。有研究表明 microRNA let-7b在熱射病大鼠血清中的表達增高，且與細胞因子 HSP70，TNF-α 和 IL-6 呈正相關［1］。因此，miRNA-193a-3p和IL-1β，TNF-α之間是否也存在某種關系?隨著miRNA-193a-3p在腫瘤中的研究被關注，我們想知道m(xù)iRNA-193a-3p在熱損傷/熱習服中的表達和相關調控機制。本研究發(fā)現在熱損傷大鼠模型中，血清中miRNA-193a-3p的表達顯著低于對照組，且與HSP70，IL-1β和TNF-α呈負相關。證明miRNA-193a-3p可能參與熱相關疾病的發(fā)病機制，這為臨床診斷熱相關疾病提供潛在的指標。但本實驗僅限于動物模型，需要進一步在病人身上進行臨床驗證和深入研究其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。