吳曉康，周維肖，馮 楠，張 毅，雷 珂，李麗華，劉澤世，許 楠，耿 燕

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710004)

結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，簡稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌?？汕址溉砀髌鞴?，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。據(jù)WHO估計(jì)，2016年全球結(jié)核病新發(fā)病例數(shù)為1040萬例，170萬人因該病死亡［1］。近年來，因免疫抑制劑的應(yīng)用、艾滋病、吸毒和貧困等原因，發(fā)病率呈上升趨勢。

目前，結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有涂片抗酸染色鏡檢法、結(jié)核桿菌血清抗體檢測、結(jié)核桿菌蛋白芯片法、結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(TSPOT)、結(jié)核桿菌核酸檢測等。其中，以T-SPOT為代表的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測方法在特異度、敏感度等方面優(yōu)于其他方法，對結(jié)核分枝桿菌的診斷起到積極的作用，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于臨床實(shí)驗(yàn)室。然而，實(shí)驗(yàn)前、中、后的一些因素會對結(jié)果和臨床診斷產(chǎn)生重要影響，此方面研究報(bào)道較少。本文依據(jù)國產(chǎn)品牌萬泰凱瑞的“結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(TB-IGRA)試劑盒”及方法，分析其影響檢測結(jié)果的各種因素，并提出應(yīng)對措施以助于提高其檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 技術(shù)操作因素

1.1 溶血 標(biāo)本溶血對本試驗(yàn)影響較大。筆者對同一患者溶血樣本與重新抽血未發(fā)生溶血樣本進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果顯著不同，以3份患者樣本為例，見表1。

表1 溶血對樣本檢測的影響

標(biāo)本溶血后，影響抗原刺激特異性淋巴細(xì)胞活化及分泌干擾素-γ(IFN-γ)減少，造成檢測數(shù)值的假性降低;另外，血紅細(xì)胞內(nèi)含量較高的物質(zhì)進(jìn)入血清，可干擾測定中的反應(yīng)過程及比色。溶血原因分為體外溶血和體內(nèi)溶血，體外溶血常見:不規(guī)范的靜脈采血［2］、過度搖晃或振蕩力量過大、樣本置于高溫或者低溫環(huán)境、不合適的離心速度和時(shí)間、樣本分離前放置時(shí)間過久等。體內(nèi)溶血常見:自身免疫性貧血、藥物反應(yīng)、重度感染、血管內(nèi)播散性凝血、輸液反應(yīng)、心臟瓣膜和HELLP(溶血、肝酶升高和血小板減少)綜合癥等。應(yīng)對措施:建議采用美國BD公司肝素抗凝真空采血管，規(guī)范的采血操作、混勻時(shí)動作輕柔、速度放慢。

1.2 樣本量不足 本試驗(yàn)所需樣本量在4 ml以上，臨床科室采血量不足時(shí)，給后續(xù)上機(jī)檢測造成檢測量不足的影響。應(yīng)對措施:首先和臨床科室積極溝通，重新采集血樣。但時(shí)常會遇見依從性不好的患者，這時(shí)拿原樣本檢測時(shí)，應(yīng)盡量保證陰性對照管(N管)、檢測管(T管)的所需量。

1.3 分裝污染 采集靜脈血后，需在2 h內(nèi)分裝到陰性對照管(N管)、檢測管(T管)、陽性對照管(P管)中進(jìn)行孵育培養(yǎng)，此步操作一般建議是按照N，T，P管順序分裝全血，其原因是不同培養(yǎng)管中試劑不同，此順序減少分裝過程中沾上培養(yǎng)管中試劑而污染下一管。同時(shí)，需要注意在分裝前，最好將空置的培養(yǎng)管短時(shí)離心一下，將黏附在管蓋上的試劑離心到底部，以減少開蓋一瞬間管中液體濺出。

1.4 孵育的溫度和時(shí)間 全血分裝N，T，P三管后，需要及時(shí)放入37℃溫箱培養(yǎng)22±2 h，此步是TB-IGRA檢測最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究比較了孵育低溫(＜25℃)和高溫(＞39℃)對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果顯示孵育溫度過低或過高都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，見表2。

表2 溫度對樣本檢測的影響

分析其原因低溫使得特異性抗原未能很好活化T淋巴細(xì)胞，從而影響γ-干擾素的產(chǎn)生;而溫度過高，可以直接造成孵育過程中的溶血。

在檢測管(T管)中，選用了致病性結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原片段(卡介苗、其他分枝桿菌沒有)與全血孵育，如果此患者感染過結(jié)核分枝桿菌，體內(nèi)存在針對這些抗原的特異性T淋巴細(xì)胞，抗原即會被識別和遞呈，刺激特異性T淋巴細(xì)胞增殖、釋放細(xì)胞因子 γ-干擾素(IFN-γ)，通過檢測 γ-干擾素來反映結(jié)核分枝桿菌是否感染。因而，此檢測等同于體內(nèi)一次免疫應(yīng)答過程，因而對反應(yīng)的溫度要求較高，應(yīng)保證37℃。

2 機(jī)體免疫因素本實(shí)驗(yàn)原理是依賴于特異性T淋巴細(xì)胞在結(jié)核抗原片段刺激下產(chǎn)生細(xì)胞因子(IFN-γ)的檢測，患者的免疫狀態(tài)如T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能活性，就對結(jié)果產(chǎn)生重要影響。實(shí)驗(yàn)中為排除假陰性結(jié)果，設(shè)置陽性對照管，多數(shù)免疫功能正常的人群其陽性對照管(P管)值往往大于5000，若患者患有慢性疾病或免疫力低下，其陽性對照管(P管)檢測數(shù)值往往偏低，可低至幾十或者幾百。應(yīng)對措施:發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常時(shí)，及時(shí)與臨床溝通了解患者病情，待患者免疫功能恢復(fù)后復(fù)查，或者結(jié)合其他結(jié)核桿菌檢測方法進(jìn)行診斷［3］。筆者在檢測中發(fā)現(xiàn)P管值低者，患者多為慢性髓系白血病、肺部腫瘤、老年慢性支氣管炎等疾病，同期血細(xì)胞檢測結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞或細(xì)胞因子數(shù)值降低。

3 藥物等其他因素免疫抑制劑在臨床上已經(jīng)被廣泛使用，如器官移植術(shù)后、血液性疾病、自身免疫性疾病等，此類患者并發(fā)結(jié)核分枝桿菌感染，檢測結(jié)果會受到影響。多數(shù)抗腫瘤的化療藥物具有骨髓抑制或免疫抑制的作用，造成淋巴細(xì)胞基礎(chǔ)水平降低，而影響TB-IGRA檢測［4］。其他，影響到機(jī)體產(chǎn)生γ-干擾素分泌的因素，理論上都會影響到該檢測，如服用糖皮質(zhì)激素后引起γ-干擾素分泌增加，結(jié)果偏高。

綜上所述，TB-IGRA檢測基于特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有高靈敏度，可用于潛伏感染的檢測，有效提高早期感染檢出的能力;采用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，排除卡介苗干擾，提高特異度，同時(shí)可鑒別非結(jié)核分枝桿菌肺部感染與肺結(jié)核，該方法具有明顯的優(yōu)勢。因此，對影響檢測結(jié)果各種因素的分析，有助于提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，更好地為結(jié)核病診斷服務(wù)。