宋俊科，張 雯，張 雪，楊海光，周啟蒙，王金華，杜冠華

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是一種多發(fā)于老年人、以黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元慢性進(jìn)行性死亡為主要特征的神經(jīng)退行性疾病［1-2］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，65歲以上人群PD患病率達(dá)到2%～3%，并且隨著老齡化社會(huì)的到來，PD患者的數(shù)量將迅速增加［3-5］。目前，對(duì)PD發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不足，尚無有效的治療手段。越來越多的證據(jù)顯示，線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激等相互作用，在PD神經(jīng)元選擇性死亡過程中發(fā)揮重要作用［6-9］。

據(jù)報(bào)道，丹酚酸類化合物在抑制氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡方面有著非常顯著的作用。丹酚酸B（salvi?anolic acid B，Sal B）能夠逆轉(zhuǎn)6-羥基多巴胺和1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridi?num ion，MPP+）造成的SH-SY5Y細(xì)胞調(diào)亡［10-13］，Sal A能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷［14］。Sal C與Sal A和Sal B具有較為相似的結(jié)構(gòu)。有研究表明，Sal C對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的活性均具有明顯的抑制作用［15］，同時(shí)Sal C能夠降低單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎CCL5和CXCL10炎癥因子的分泌［16］。然而到目前為止，尚無關(guān)于Sal C神經(jīng)保護(hù)作用方面的報(bào)道?？紤]到Sal A和Sal B作為Sal C的類似物具有較好的抗MPP+損傷或神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，本研究選擇SH-SY5Y細(xì)胞為研究對(duì)象，采用MPP+誘導(dǎo)SHSY5Y細(xì)胞損傷模型研究Sal C對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

Sal C購自中國源葉生物科技有限公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、線粒體超氧化物指示劑（mitochondrial super?oxide indicator，MitoSOX）和2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diace?tate，DCFH-DA）均購自美國Thermo scientific公司；MPP+，Hoechst33258和四甲基偶氮唑鹽（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）均購自美國Sigma公司；Alexa Fluor 488綠色熒光標(biāo)記二抗、蛋白裂解液、β肌動(dòng)蛋白、Bax、Bcl-2和活化的胱天蛋白酶3抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（nicotinamide adenine dinucleo?tide phosphate oxidase 2，NADPH oxidase 2，NOX2）和細(xì)胞色素c抗體購自英國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒購自中國普利萊公司；吖啶橙（acridine orange，AO）/溴化乙啶（ethidium bromide，EB）雙染試劑盒購自中國索萊寶科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自中國碧云天生物技術(shù)公司；其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純。蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及Molecular Imager Chemi Doc XRS+System成像儀購自美國Bio-Rad公司；Spectra Max M5酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司；Thermo Scientific ArrayScan Infinity高內(nèi)涵分析儀購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。SH-SY5Y細(xì)胞用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，37°C，5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞損傷模型制備和分組

細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，接種于96孔板。正常對(duì)照組始終使用完全培養(yǎng)基在常氧培養(yǎng)箱孵育24 h。加藥組給予不同濃度的Sal C（0.1，1.0和5.0 μmol·L-1）及陽性藥NAC（5 mmol·L-1），2 h 后加入 MPP+（終濃度為 500 μmol·L-1），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同時(shí)設(shè)單加 Sal C 5.0 μmol·L-1組和 MPP+500 μmol·L-1組（模型組）。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率

取1.3分組處理的細(xì)胞，吸除原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL MTT溶液（0.5 g·L-1），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后吸除MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO振蕩，待結(jié)晶完全溶解后在490 nm處測定吸光度（A490nm），計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A490nm-空白對(duì)照組A490nm）（/正常對(duì)照組A490nm-空白對(duì)照組A490nm）×100%。

1.5 吖啶橙/溴化乙啶染色檢測細(xì)胞凋亡

取1.3分組處理的細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL PBS洗滌2次，之后加入100 μL AO/EB染色工作液（AO∶EB=1∶1，終濃度為1 g·L-1），室溫靜置2 min，于Cellomics Arrayscan高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測?；罴?xì)胞的核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)，而顯著凋亡的細(xì)胞的核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀，計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 DCFH-DA和MitoSOX檢測SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）及線粒體內(nèi)超氧化物水平

取1.3分組處理的細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入50 μL含有DCFH-DA 10 μmol·L-1或MitoSOX 5 μmol·L-1及 Hoechst33258 10 mg·L-1的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃避光孵育30 min。PBS洗滌3次。應(yīng)用Cellomics Array?scan高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測，使用ImageJ軟件進(jìn)行熒光處理計(jì)算，用熒光強(qiáng)度值表示細(xì)胞內(nèi)ROS及線粒體內(nèi)超氧化物的水平。

1.7 線粒體膜電位JC-1的測定

取1.3分組處理的細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液上清，用PBS洗滌1次，每孔加入50 μL含有1×JC-1染色工作液及Hoechst33258 10 mg·L-1的培養(yǎng)基，37℃孵育20 min。JC-1染色緩沖液洗滌2次。加入100 μL培養(yǎng)基，應(yīng)用Cellomics Arrayscan高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測，使用ImageJ軟件進(jìn)行熒光處理計(jì)算，按照J(rèn)C-1檢測結(jié)果的常用表示方法，以紅色熒光/綠色熒光的比值反映線粒體膜電位高低。

1.8 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測Bax、Bcl-2、活化的胱天蛋白酶3和細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)

取1.3分組處理的細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min后，4℃，12000×g離心10 min，用以提取細(xì)胞總蛋白，將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中。依據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒步驟進(jìn)行蛋白定量。之后加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min。采用等量上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜置于5%BSA封閉2 h，之后用TBST稀釋后的Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、活化的胱天蛋白酶3（1∶1000）、細(xì)胞色素c（1∶500）和β肌動(dòng)蛋白（1∶1000）抗體于4℃孵育過夜?；厥湛贵w后的PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10 min；再置于稀釋后的對(duì)應(yīng)種屬的二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后顯色成像。應(yīng)用Gel-Pro analyzer 4.0圖像分析系統(tǒng)，對(duì)所得條帶進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)算條帶吸光度值。目標(biāo)蛋白與β肌動(dòng)蛋白吸光度值的比值表示目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 免疫熒光檢測NADPH氧化酶2的表達(dá)和細(xì)胞色素c的釋放

取1.3分組處理的細(xì)胞，吸除原培養(yǎng)液，用PBS洗1次，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛，于37°C孵育15 min。PBS洗1次后，每孔加入50 μL 0.3%Triton X-100，于37°C繼續(xù)孵育10 min。接著，用PBS洗1次，每孔加入50 μL 5%BSA 37℃封閉1 h。之后，加入稀釋后的NOX2（1∶100）和細(xì)胞色素c（1∶200）抗體，于4℃孵育過夜。然后，用PBS洗3次，每次10 min，每孔加入50 μL熒光二抗稀釋液，于37℃孵育1.5 h。PBS洗3次，每次10 min，最后加入Hoechst33258溶液，37℃孵育 30 min，PBS洗1次，于Cellomics Arrayscan高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測，使用ImageJ軟件進(jìn)行熒光處理計(jì)算，用熒光強(qiáng)度值表示相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，使用Graph Pad Prism version 6.0（GraphPad Software，CA，USA）軟件中One-way ANOVA（Tukey′spost hoctest）方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SalC對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞存活的影響

如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，Sal C 5.0 mmol·L-1單獨(dú)作用對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活無明顯影響。MPP+500 μmol·L-1損傷 24 h 后，SHSY5Y細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）。Sal C 1.0和5.0 μmol·L-1及陽性藥 NAC 5 mmol·L-1能夠逆轉(zhuǎn)MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞造成的損傷，顯著提高SHSY5Y細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of salvianolic acid C（Sal C）on cell viability of SH-SY5Y cells injured by MPP+.SH-SY5Y cells were pre-treated with Sal C（0.1，1.0 and 5.0 μmol·L-1）or N-acetyl-L-cysteine（NAC）5 mmol·L-1for 2 h.Then，the cells were treated with or without MPP+500 μmol·L-1for 24 h.±s，n=4. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MPP+group.

2.2 Sal C對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

如圖2A所示，正常對(duì)照組活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，MPP+損傷模型組細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)，呈現(xiàn)橘紅色熒光。如圖2B所示，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，Sal C（1.0和5.0 μmol·L-1）和 NAC 5 mmol·L-1能夠顯著降低細(xì)胞凋亡率（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of Sal C on apoptosis of SH-SY5Y injured by MPP+.See Fig.1 for the cell treatment.The apoptosis was monitored using AO/EB staining(A and B).Scale bar=20 μm.White arrows show live cells；Yellow arrows show apoptotic cells.

2.3 Sal C對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

如圖3A所示，與正常對(duì)照組比較，MPP+損傷導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低（P＜0.01），促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加（P＜0.01）。Sal C給藥組能夠降低MPP+誘導(dǎo)的Bax表達(dá)升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SalC 1.0和5.0 μmol·L-1可以顯著抑制MPP+誘導(dǎo)Bcl-2的降低（均P＜0.01）。如圖3B所示，MPP+損傷導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，Sal C 1.0和5.0 μmol·L-1能夠顯著降低Bax/Bcl-2比值（P＜0.01），維持Bax和Bcl-2表達(dá)平衡。

Fig.3 Effect of Sal C on Bax and Bcl-2 levels in SHSY5Y cells injured by MPP+by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with MPP+group.

2.4 Sal C對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞ROS和NOX2的影響

如圖4A和圖4B所示，與正常對(duì)照組相比，MPP+組細(xì)胞ROS釋放顯著增加（P＜0.01），而Sal C 1.0和5.0 μmol·L-1均能顯著降低MPP+損傷導(dǎo)致的ROS釋放（P＜0.01）。如圖4C和圖4D所示，模型組細(xì)胞內(nèi)NOX2的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，Sal C 0.1，1.0和5.0 μmol·L-1可顯著抑制MPP+損傷導(dǎo)致的NOX2表達(dá)升高（均P＜0.01）。如圖4E和圖4F所示，模型組MitoSOX熒光強(qiáng)度顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），Sal C 0.1，1.0和5.0 μmol·L-1可以顯著抑制線粒體中超氧化物的釋放（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of Sal C on reactive oxygen species（ROS）content and nicotinamide adenine dinucleo?tide phosphate oxidase 2（NOX2）production of SH-SY5Y cells injured by MPP+.See Fig.1 for the cell treatment.B，D and F was the semi-quantitative result of A，C and E，respec?tively. ± s，n=4. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with MPP+group.Scale bar=20 μm.

2.5 Sal C對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖5所示，正常對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位較高，JC-1以聚合物形式聚集在線粒體基質(zhì)中，產(chǎn)生紅色熒光。與正常對(duì)照組相比，MPP+損傷SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位降低，JC-1以單體形式存在，熒光由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，線粒體膜電位顯著下降（P＜0.01）。Sal C 1.0和5.0 μmol·L-1可以顯著抑制MPP+損傷造成SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.5 Effect of Sal C on mitochondrial membrane poten?tial of SH-SY5Y cells injured by MPP+by JC-1 fluores?cence method.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MPP+group.Scale bar=20 μm.

2.6 Sal C對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中細(xì)胞色素c釋放和胱天蛋白酶3活化的影響

Western蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，MPP+損傷會(huì)使細(xì)胞色素c釋放量顯著上升（P＜0.01），而Sal C 1.0和5.0 μmol·L-1能顯著降低MPP+引起的SH-SY5H細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素c的釋放（P＜0.01）（圖6A和B）。進(jìn)一步采用免疫熒光法檢測SH-SY5Y細(xì)胞中細(xì)胞色素c的釋放，如圖6C和D所示，MPP+可以誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素c釋放，而Sal C能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的線粒體細(xì)胞色素c釋放（P＜0.01）。如圖6E和F所示，而Sal C 1.0和5.0 μmol·L-1能夠顯著降低 MPP+損傷引起的胱天蛋白酶3的活化（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of Sal C on release of cytochrome c（A-D）and expression of cleaved caspase 3（E，F(xiàn)）of SH-SY5Y cells injured by MPP+by immunofluorescence method or by Western blotting.See Fig.1 for the treatment.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MPP+group.Scale bar=20 μm.

3 討論

本研究結(jié)果表明，MPP+損傷導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著降低，NOX2蛋白表達(dá)顯著增加，并且線粒體內(nèi)超氧化物水平顯著提高，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS過量生成，線粒體膜電位下降，最終誘發(fā)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。Sal C在0.1～5 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，可以提高M(jìn)PP+損傷后細(xì)胞存活率，抑制MPP+損傷SH-SY5Y細(xì)胞NOX2的表達(dá)，降低線粒體超氧化物水平，減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS生成，改善MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，減緩線粒體膜電位去極化，抑制細(xì)胞凋亡。

引發(fā)PD的因素包括遺傳、老化、環(huán)境、氧化應(yīng)激、線粒體障礙、神經(jīng)炎癥、鐵代謝異常、α-突觸核蛋白異常聚集和表達(dá)等［17-19］。研究表明，PD患者腦內(nèi)存在明顯的線粒體能量代謝異常，介導(dǎo)線粒體功能障礙而產(chǎn)生氧化應(yīng)激［20］。MPTP作為一種神經(jīng)毒素，其主要毒性表現(xiàn)為影響細(xì)胞內(nèi)能量消耗及自由基產(chǎn)生。MPP+是MPTP的代謝產(chǎn)物，通過高親和力的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體被選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)被線粒體吸收，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化過程，導(dǎo)致ATP產(chǎn)生降低，自由基生成增多［21-23］。

細(xì)胞內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)對(duì)維持細(xì)胞正常功能至關(guān)重要，過量的ROS是神經(jīng)退行性疾病的重要特征，參與神經(jīng)元凋亡［23］。NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)ROS的重要來源，NOX2是NADPH氧化酶的亞基，其通過質(zhì)膜傳輸電子以產(chǎn)生ROS［24］。線粒體是細(xì)胞凋亡的控制中心，也是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，MPP+引起SH-SY5Y細(xì)胞中NOX2蛋白表達(dá)顯著增加，線粒體超氧化物水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過量ROS。Sal C能顯著抑制MPP+誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞內(nèi)NOX2蛋白表達(dá)及線粒體超氧化物水平的增加，從而降低細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。

Bcl-2蛋白家族的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bax可形成同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；也可以與Bcl-2形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡，且異源二聚體的穩(wěn)定性大于同源二聚體［25］。MPP+損傷引起線粒體中超氧化物及細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，激活Bcl-2蛋白家族。降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提高胞質(zhì)中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，顯著提高Bax與Bcl-2的比值，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Sal C能夠維持Bax/Bcl-2比值的平衡，抑制凋亡發(fā)生。

當(dāng)促凋亡蛋白Bax活性高于抑凋亡蛋白Bcl-2時(shí)，Bax構(gòu)象發(fā)生改變，并易位于線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體膜通透性改變，膜電位降低［26］。上述過程進(jìn)而引起線粒體相關(guān)凋亡因子細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合，形成凋亡體，促進(jìn)胱天蛋白酶3的活化，引發(fā)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，Sal C能夠減緩線粒體膜電位去極化，抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制MPP+誘導(dǎo)的線粒體細(xì)胞色素c釋放與胱天蛋白酶3的活化程度。

綜上所述，Sal C通過抑制NOX2的表達(dá)，減少線粒體超氧化物的生成，降低MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞總ROS的增加，改善SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。且Sal C能夠維持Bax/Bcl-2比值的平衡，減緩線粒體膜電位去極化，抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制MPP+誘導(dǎo)的線粒體細(xì)胞色素c釋放與胱天蛋白酶3的活化，最終抑制細(xì)胞凋亡。