顧 浩，陳寅螢，王朋倩，王 忠

（中國中醫(yī)科學(xué)院1.中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，3.中藥研究所，北京 100700；2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院科研處，北京 100053）

冠心病是冠狀動脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞或（和）因冠狀動脈功能性改變（痙攣）導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的一類心臟?。?］。目前已知的冠心病致病基因達(dá)上百個(gè)，且關(guān)系網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，利用單基因單靶點(diǎn)的一對一分析，很難發(fā)現(xiàn)核心致病基因群及其主要的生物學(xué)功能［2］。利用網(wǎng)絡(luò)模塊劃分方法，可以更好地分析疾病網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能，有助于發(fā)現(xiàn)疾病關(guān)鍵基因群［3］。

隨著組學(xué)技術(shù)和大數(shù)據(jù)的發(fā)展，生命科學(xué)在人體和疾病的生物分子層面積累了大量的數(shù)據(jù)［4-5］，網(wǎng)絡(luò)為大量生物信息的整合提供了有效手段［6-7］?；谏锞W(wǎng)絡(luò)的模塊劃分方法，成為網(wǎng)絡(luò)簡化分解和抽提新知識的重要途徑［8-9］。從網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)在模塊中的分布重疊情況，模塊劃分方法可以分為重疊模塊和非重疊模塊劃分方法。目前，常用的重疊模塊劃分方法主要包括MCLiQUE，Cluster one，NCMine，PEW?CC和Fuzzifier cluster等算法［10］。非重疊模塊劃分方 法 包 括 Community cluster（glay），Connected component cluster，MCL cluster，MCODE cluster，Spectral clusters of protein sequences和AP等［11］。

面對眾多的模塊劃分方法，如何選擇一個(gè)優(yōu)化的模塊劃分方法對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能解析，從而得到一個(gè)相對穩(wěn)定可靠的結(jié)果，是目前模塊研究的重要內(nèi)容。有研究者提出了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵的概念，可以有效地刻畫無尺度網(wǎng)絡(luò)的無序性［12-15］。本研究團(tuán)隊(duì)前期利用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵計(jì)算方法，對中藥成分干預(yù)腦缺血的藥理網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了模塊劃分結(jié)果的熵值計(jì)算［15］。用最小網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵刻畫節(jié)點(diǎn)間的關(guān)系，熵越小，節(jié)點(diǎn)間越相似，那么識別出來的功能模塊就越穩(wěn)定，這為本研究進(jìn)一步篩選疾病網(wǎng)絡(luò)模塊劃分方法提供了可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。

本研究以冠心病為例，利用重疊模塊和非重疊模塊等多種常用模塊劃分方法，解析冠心病基因網(wǎng)絡(luò)；通過最小網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵值，判定適用于冠心病基因的模塊識別的最佳方法；利用杰卡德相似系數(shù)（Jaccard similarity coefficient）分析冠心病網(wǎng)絡(luò)和模塊網(wǎng)絡(luò)功能的相關(guān)性，為簡化和理解疾病網(wǎng)絡(luò)提供一種可行方案。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

2017年6月10日，以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞檢索美國NCB（I生物科技信息中心基因數(shù)據(jù)庫，National Center for Biotechnology Infor?mation，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），收集到302個(gè)冠心病相關(guān)基因。

利用String數(shù)據(jù)庫的文本挖掘功能，發(fā)現(xiàn)上述基因之間的相關(guān)關(guān)系，從而構(gòu)建基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。將302個(gè)冠心病相關(guān)基因，輸入String數(shù)據(jù)庫，選擇智人（Homo sapiens）屬，能夠識別其中284個(gè)基因。在此基礎(chǔ)上，以綜合積分（score≥0.4）為條件篩選基因之間的相關(guān)關(guān)系，得到1個(gè)由284個(gè)節(jié)點(diǎn)和3039條邊構(gòu)成的冠心病相關(guān)基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，相關(guān)參數(shù)見表1。從表1可以看出，網(wǎng)絡(luò)中共有284個(gè)節(jié)點(diǎn)，3039條邊，平均節(jié)點(diǎn)度21.4，平均局部聚集系數(shù)0.531，期望邊數(shù)881條。

Tab.1 Topological parameters of coronary heart disease related gene network

本研究利用多種模塊劃分方法對冠心病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了模塊劃分，并利用David數(shù)據(jù)庫（DAVID Bioin?formatics Resources 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進(jìn)行了冠心病網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)通路富集分析。

1.2 研究方法

1.2.1模塊劃分方法

本研究對前述的11種常用方法均進(jìn)行了計(jì)算，除AP算法不能成功劃分出模塊，其他方法均可。因此，本研究在能劃分出模塊方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展熵值計(jì)算。

1.2.2熵值計(jì)算方法

網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵（network structure entropy）［15］，計(jì)算公式如下：

其中，N為網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)目，Ii為第i個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要度。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵由節(jié)點(diǎn)的連接度分布確定，因此，節(jié)點(diǎn)的重要度定義為每個(gè)節(jié)點(diǎn)連接度占所有節(jié)點(diǎn)連接度總和的比例。

1.2.3杰卡德相似系數(shù)

杰卡德相似系數(shù)用來度量2個(gè)集合之間的相似性，被定義為2個(gè)集合A和B的交集元素在A和B的并集中所占的比例，稱為2個(gè)集合的杰卡德相似系數(shù)，用符號J（A，B）表示。公式如下：

利用David數(shù)據(jù)庫富集模塊的相關(guān)通路，可以得到每個(gè)模塊的通路集合。要比較模塊相似性，可以通過比較不同模塊的通路集合的相似系數(shù)，評價(jià)模塊之間功能的相關(guān)性。

1.3 研究技術(shù)路線

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收集的冠心病相關(guān)基因通過String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。針對冠心病基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，利用12種重疊模塊和非重疊模塊的劃分方法，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)模塊劃分，得到12個(gè)模塊劃分結(jié)果網(wǎng)絡(luò)。利用網(wǎng)絡(luò)信息熵的計(jì)算方法對12個(gè)結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，確定熵值最低的劃分結(jié)果以及相應(yīng)的劃分方法為MCODE cluster。用MCODE cluster方法劃分共得到11個(gè)模塊，利用David數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析，分析冠心病基因網(wǎng)絡(luò)和11個(gè)模塊的生物信號通路。利用杰卡德相似系數(shù)比較劃分前后網(wǎng)絡(luò)的生物信號通路之間的相似度，從而評價(jià)網(wǎng)絡(luò)模塊劃分結(jié)果是否與原網(wǎng)絡(luò)功能一致（圖1）。

2 結(jié)果

2.1 模塊劃分方法比較

基于11種模塊劃分方法劃分模塊，然后計(jì)算模塊網(wǎng)絡(luò)熵值（表2）。熵值越小，網(wǎng)絡(luò)的混亂度越低，越趨于穩(wěn)定。上述方法劃分模塊后，計(jì)算熵值，比較熵值大小，發(fā)現(xiàn)MCODE cluster方法得到熵值最低，為4.33637。說明MCODE cluster方法比較適合冠心病基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的模塊劃分。因此，選取MCODE cluster方法劃分的模塊網(wǎng)絡(luò)為研究對象，進(jìn)行下一步計(jì)算和分析。

2.2 基于最優(yōu)算法MCODE cluster的模塊劃分結(jié)果

Fig.1 Work flow diagram for gene network construction and analysis of coronary heart disease.The work flow diagram consists of four parts：the construction of the disease gene network，the module division based on 11 methods，the module division method evaluation by entropy value，and the function analysis of the module division result.★：the method with the lowest entropy.

Tab.2 Entropy calculation of results of module division

基于MCODE cluster方法，劃分模塊網(wǎng)絡(luò)結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，11個(gè)內(nèi)部相互連接、外部相對獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)集團(tuán)即為模塊?；贛CODE cluster方法，冠心病基因網(wǎng)絡(luò)被劃分為11個(gè)模塊，詳細(xì)信息如表3所示。圖2中第1排從左到右依次為1～5號模塊，從表3中可以看到相關(guān)模塊內(nèi)包含的基因名稱。圖1第2排從左到右，依次為6～11號模塊。其中，模塊1包含51個(gè)節(jié)點(diǎn)，926條邊，是網(wǎng)絡(luò)中最大的模塊。模塊8，9，10和11均包含3個(gè)節(jié)點(diǎn)，3條邊，是網(wǎng)絡(luò)中最小的模塊。

2.3 基于David數(shù)據(jù)庫冠心病基因功能富集分析

為探討原網(wǎng)絡(luò)和劃分后的模塊網(wǎng)絡(luò)在生物功能上的相關(guān)性，基于David生物信息分析平臺，對冠心病原網(wǎng)絡(luò)和劃分后11個(gè)模塊網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行基因的相關(guān)信號通路富集分析。最終富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心病原網(wǎng)絡(luò)中基因涉及52條KEGG信號通路（P＜0.05），由于篇幅有限，表4中展示其中15條通路。

11個(gè)模塊富集結(jié)果總共涵蓋冠心病相關(guān)通路中的38條通路，覆蓋率達(dá)73.1%。在功能上說明劃分后的模塊能夠表達(dá)原疾病網(wǎng)絡(luò)的絕大部分功能。圖3可以看出11個(gè)模塊分別在冠心病通路中所占的比例分布。模塊1占46.6%，模塊2占1.6%，模塊3占7.8%，模塊4占4.7%，模塊5和6占0.0%，模塊7占10.9%，模塊8，9和10占0.0%，模塊11占1.6%。

Fig.2 Eleven modules of coronary heart disease network divided by MCODE method.SEL:selectin;CCR:C-C motif chemokine receptor;MMP:matrix metallopeptidase;CXCL:C-X-C motif chemokine ligand;IL:interleukin;ICAM:intercellular adhesion molecule;TGFB:transforming growth factor beta;FGF:fibroblast growth factor;VEGFA:vascular endothelial growth factor A;IFNG:interferon gamma;KDR:kinase insert domain receptor;VCAM:vascular cell adhesion molecule;VWF:von Willebrand factor;LDLR:low density lipoprotein receptor;ALB:albumin;NOS:nitric oxide synthase;CCL:C-C motif chemokine ligand;TNF:tumor necrosis factor;SCARB:scavenger receptor class B;CRP:C-reactive protein;EDN1:endothelin 1;INS:insulin;SERPINE:serpin family E;ESR1:estrogen receptor 1;AGTR:angiotensin Ⅱ receptor;LEP:leptin;ACE:angiotensin I converting enzyme;IGF:insulin like growth factor;RETN:resistin;ADIPOQ:adiponectin;C1Q and collagen domain containing;PPAR:peroxisome proliferator activated receptor;HMGCR:3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A reductase;CETP:cholesteryl ester transfer protein;LCAT:lecithin-cholesterol acyltransferase;APO:apolipoprotein;LIPC:lipase C;hepatic type;NQO:NAD(P)H quinone dehydrogenase;GST:glutathione S-transferase;EPHX1:epoxide hydrolase 1;CYP:cytochrome P450;NAT:N-acetyltransferase;PLA:phospholipase A;NR1H:nuclear receptor subfamily 1 group H;ABC:ATP binding cassette;SREBF:sterol regulatory element binding transcription factor;NPC1L:NPC1 like intracellular cholesterol transporter;PCSK:proprotein convertase subtilisin/kexin;CXCR:C-X-C motif chemokine receptor;P2RY12:purinergic receptor P2Y12;CNR:cannabinoid receptor;POMC:proopiomelanocortin;AR:androgen receptor;GHRL:ghrelin and obestatin prepro?peptide;PTH:parathyroid hormone;IGFBP:insulin like growth factor binding protein;HTR:5-hydroxytryptamine receptor;UTS:urotensin;F2RL:F2R like thrombin or trypsin receptor;HTR:5-hydroxytryptamine receptor;KALRN:kalirin RhoGEF kinase;CX3C:C-X3-C motif chemokine;CTLA:cytotoxic T-lymphocyte associated protein;FCGR:Fc fragment of IgG receptor;HIF1A:hypoxia inducible factor 1 alpha subunit;ANGPT:angiopoietin;HBA1:hemoglobin subunit alpha 1;GAS:growth arrest specific;FGB:fibrinogen beta chain;CLU:clus?terin;FTO:alpha-ketoglutarate dependent dioxygenase;TCF:transcription factor;F11:coagulation factor XI;GP1BA:glycoprotein Ib platelet alpha subunit;PROC:protein C,inactivator of coagulation factors Va and VIIIa;KCNJ:potassium voltage-gated channel subfamily J.

Tab.3 Eleven modules of coronary heart disease network

Tab.4 Pathway enrichment of coronary heart disease related genes

MCODE cluster模塊劃分方法對劃分出的網(wǎng)絡(luò)模塊進(jìn)行了評分和排序，密度大模塊評分高，根據(jù)評分高低對模塊編號和排序［16］。按照這一評分方案作為判定模塊主次的依據(jù)，則該方法劃分的主要模塊為1號模塊，其涉及通路包括過氧化物酶體增生物激活受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、造血細(xì)胞譜系、雌激素信號通路、肥厚性心肌病、Jak-STAT信號通路和趨化因子信號通路等30個(gè)信號通路，占冠心病相關(guān)通路的46.6%。因此，主要模塊與冠心病功能一致度較高。

Fig.3 Distribution of module-related pathways in coro?nary heart disease.

3.4 利用杰卡德相似系數(shù)模塊功能相似度分析，驗(yàn)證基于熵值所獲得的冠心病基因網(wǎng)絡(luò)模塊劃分結(jié)果的合理性

無論模塊如何劃分，最終目的都是在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中找到結(jié)構(gòu)和功能相對獨(dú)立的基團(tuán)。熵值的方法從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和能量角度，評價(jià)了模塊劃分方法的生物穩(wěn)定性?；诮芸ǖ孪嗨葡禂?shù)的模塊功能相似度分析，可以評價(jià)各個(gè)模塊與疾病功能的相關(guān)性。因此，本部分采用杰卡德相似系數(shù)，從生物功能角度，驗(yàn)證基于熵值所獲得的冠心病基因網(wǎng)絡(luò)模塊的合理性。

表5中顯示了11個(gè)模塊所富集到的通路數(shù)量、與疾病總網(wǎng)絡(luò)相比較的交集和并集，以及通過交集與并集計(jì)算的杰卡德相似系數(shù)。同時(shí)列出了11個(gè)模塊基因數(shù)與疾病總網(wǎng)絡(luò)基因數(shù)的比例。

利用折線圖4，可以更直觀地顯示基因占比和杰卡德相似系數(shù)的關(guān)系。橫坐標(biāo)表示模塊編號，縱坐標(biāo)代表模塊網(wǎng)絡(luò)與疾病總網(wǎng)絡(luò)相比較，在通路功能和基因數(shù)量上所占的比例，即杰卡德相似系數(shù)和模塊基因數(shù)占比。

Fig.4 Comparison of number and function of genes between coronary heart disease and its modules.

從結(jié)果可以看出，杰卡德相似系數(shù)在模塊1，3，4，和7中，相對于基因占比平均高出1倍以上。模塊1基因數(shù)占比接近0.17，但代表疾病相關(guān)通路占比的杰卡德相似系數(shù)卻超過0.38。同理，模塊3，4和7均用較少的基因富集到較多的功能。這一結(jié)果表明，模塊在功能富集上具有一定優(yōu)勢。模塊2，5，6，8，9，10和11基因占比與功能杰卡德相似系數(shù)基本一致，差異較小。通過此方法，還可判斷功能富集能力較高的模塊，從而為評價(jià)主要模塊和次要模塊提供另一個(gè)可參考指標(biāo)。

Tab.5 Comparison of pathway levels and gene levels between 11 modules and coronary heart disease network

3 討論

基于生物網(wǎng)絡(luò)的模塊劃分方法，旨在實(shí)現(xiàn)將大量分子作功能分區(qū)的劃歸，化繁為簡，達(dá)到從不同尺度理解生命活動的層級和結(jié)構(gòu)的目的，從而針對分區(qū)進(jìn)行有效的干預(yù)和調(diào)控。但目前模塊劃分方法多樣，如何評價(jià)和選擇適合疾病網(wǎng)絡(luò)的模塊劃分方法，是值得醫(yī)藥學(xué)關(guān)注的問題。

本研究通過多種常用模塊劃分方法，對冠心病基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了模塊劃分，劃分結(jié)果通過網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵值計(jì)算進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)MCODE cluster方法劃分出11個(gè)模塊，網(wǎng)絡(luò)熵值為4.33637，在幾種方法中熵值最小，較為適用于冠心病基因網(wǎng)絡(luò)的模塊識別?；贒avid數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)冠心病相關(guān)基因涉及52條KEGG信號通路（P＜0.05），11個(gè)模塊總共能涵蓋冠心病相關(guān)通路中的38條通路，覆蓋率達(dá)到73.07%，說明模塊網(wǎng)絡(luò)能夠表達(dá)原疾病網(wǎng)絡(luò)的絕大部分功能。利用杰卡德相似指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)第3，4和7模塊都用較少的基因，富集到較多的功能，這一結(jié)果表明模塊在功能富集上有一定優(yōu)勢。

本研究使用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)熵方法，具有明確的物理意義，熵值越小，網(wǎng)絡(luò)的混亂度越低，越趨于穩(wěn)定，適用于對所有模塊劃分結(jié)果網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性評價(jià)。通過對冠心病基因網(wǎng)絡(luò)的實(shí)踐，表明該方法能夠?yàn)榛蛳嚓P(guān)疾病網(wǎng)絡(luò)的簡化和解析提供依據(jù)，并為進(jìn)一步基于疾病模塊的組合藥物設(shè)計(jì)與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。