湯依群，馮 凱，梁時雨，吳啟權，潘奕彤，劉婷婷

（中國藥科大學基礎醫(yī)學與臨床藥學學院，江蘇南京 211198）

心動過緩是臨床常見疾病，多見于老年或心臟有疾病的患者，可出現(xiàn)眩暈、心絞痛，甚至導致心衰［1］。目前心動過緩造模方法主要有以下幾類：①直接給予心臟抑制性藥物，如乙酰膽堿和普萘洛爾等［2-4］。此類方法造模方便，但動物種屬差異性大，與臨床心動過緩發(fā)病機制不同。②化學物質損傷法，即將甲醛或NaOH等注射至右心房，造成竇房結局部損傷［5］，模擬病竇發(fā)生。此類方法操作較復雜，損傷程度難控制，重現(xiàn)性差。③刺激迷走神經(jīng)干引起心率減慢［6］。此法動物心率減慢程度與受刺激動物的種屬及刺激頻率相關，多用于制備急性模型，較少用于心動過緩發(fā)病機制的研究。制備與臨床發(fā)病機制相關且重現(xiàn)性好的心動過緩動物模型，是研究心動過緩發(fā)病機制及評價干預措施療效的關鍵。

臨床數(shù)據(jù)顯示，心肌梗死患者易發(fā)生心動過緩［7］。左冠狀動脈結扎術可以引起心肌缺血、心肌重構、誘發(fā)心率失常和心衰，是本實驗室常用的動物模型［8］。Goldstein等［9］發(fā)現(xiàn)，右冠狀動脈阻塞導致心肌梗死患者易發(fā)生心動過緩。本研究通過結扎大鼠右冠狀動脈分支，引起右心房供血障礙，損傷竇房結細胞，建立大鼠缺血性心動過緩模型。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

雄性SD大鼠，SPF級，體質量250～300 g，購自南京市青龍山動物養(yǎng)殖場，動物許可證號為SCKX（浙）2014-0001。動物飼養(yǎng)條件符合中國藥科大學實驗動物福利倫理委員會的要求，大鼠實驗前適應性飼養(yǎng)1周，溫度23～25℃，濕度50%～70%，明暗交替12 h飼養(yǎng)，每天更換墊料。

Trizol和BCA試劑盒，碧云天生物技術有限公司；ECL顯色劑，上海生工生物有限公司；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（A00227-1）和HRP-羊抗兔lgG多克隆抗體（BA1054），博士德生物有限公司；兔抗大鼠超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道亞型4（hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated cation channel 4，HCN4）蛋白多克隆抗體（bs-1691R），北京博奧森生物技術有限公司；兔抗大鼠鈉鈣交換蛋白1（sodium calcium exchanger 1，NCX1）單克隆抗體（ab177952），美國abcam公司。

TE124S電子天平（萬分之一），德國Sartorius公司；Versamax光吸收型酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Bioshine Chemi Q4600mini化學發(fā)光成像儀，上海歐翔科學儀器有限公司；HX-300S動物呼吸機、BL-420S生物信號采集與分析系統(tǒng)和PT-100壓力轉換器，成都泰盟軟件有限公司；TGLM20高速低溫離心機，凱達科學儀器有限公司。

1.2 動物分組及手術

動物適應性飼養(yǎng)1周后，ip水合氯醛300 mg·kg-1麻醉，將BL-420S生物信號采集與分析系統(tǒng)的白色，黑色和紅色電極分別插入大鼠右前肢，右后肢和左后肢的皮下，測量Ⅱ導聯(lián)心電圖，將心電圖正常大鼠隨機分成3組：左冠狀動脈結扎組，右冠狀動脈結扎組和假手術組，每組6只。

左冠狀動脈結扎［8］：大鼠麻醉后記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖（麻醉方法同上）。連接呼吸機（潮氣量：13 mL，呼吸比：2∶1，呼吸頻率：70 min-1），左胸皮膚縱向切開，分離胸肌，在第4肋間打開胸腔隔膜和心包膜。輕微擠壓胸部使心臟露出胸腔。左冠狀動脈左前降支（left anterior descending，LAD）起始部位下約2 mm處，用5-0縫合線結扎。心電圖Ⅱ導聯(lián)中ST段抬高，認定結扎成功。心臟放回胸腔，排出空氣。對大鼠肌肉和皮膚逐層縫合?？p合完畢后，除去呼吸機。整個手術過程注意無菌操作，避免傷口感染帶來的大鼠死亡或心率等指標的改變。

右冠狀動脈結扎：動物麻醉及開胸方法同前，用蚊式鉗分離胸肌并且在第4肋間打開胸腔隔膜和心包膜，輕微擠壓胸部使心臟露出胸腔。右冠狀動脈的右緣支（right marginal artery，RMA）位于右心耳下緣及心尖中點處，用5-0縫合線結扎右緣支起點處。心電圖Ⅱ導聯(lián)中ST段抬高，為結扎成功標志。后續(xù)動物處理同左冠狀動脈結扎。

假手術組：動物麻醉及開胸方法同前，在大鼠左、右冠狀動脈相應位置穿線后，將心臟放回胸腔，之后同法縫合，處理。

各組動物手術全過程，以及術后第5天（d5），d10和d15記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖。術后d16進行血流動力學實驗以測量心功能，剪取心臟組織，部分放置于4%甲醛溶液中為組織學實驗做準備，其余放在-80℃冰箱凍存進行分子生物學實驗。

1.3 大鼠心功能測定

大鼠術后d16，麻醉，分離右側頸總動脈，聚乙烯導管插入頸總動脈，連接PT-100壓力轉換器。通過觀察顯示器波形變化，將插管從頸動脈推入大鼠左心室內(nèi)，記錄4個心臟血流動力學指標衡量大鼠心功能狀態(tài)：左心室內(nèi)壓最大下降速率（maximal rate of decline of ventricular pressure，-dp/dtmax），左心室內(nèi)壓最大上升速率（maximal rate of rise of ventricular pressure，+dp/dtmax），左心室終末舒張壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）和左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）。

1.4 HE和Masson染色進行病理組織學檢查

術后d16，大鼠處死，暴露心臟，在體原位尋找大鼠右側上腔靜脈，沿上腔靜脈遠端與心臟相連的大血管根部離斷血管，取下完整心臟，剪下右心房及與之相連的上腔靜脈，分離并去除上腔靜脈周圍的結締組織，進一步修剪取下來的組織，去除多余部分，以上腔靜脈與右心房交界區(qū)為中心，上下各1.5 cm處橫斷上腔靜脈與右心房，取下的組織部分包含竇房結。剪取1/2用于病理組織學檢測。剩余組織凍存于-80℃冰箱，用于分子生物學測定。將包含竇房結的右心房組織放置于4%甲醛中固定48 h，脫水，包埋，切片（5 μm），固定于載玻片上，晾干備用。進行HE染色和Masson染色，顯微鏡下觀察，拍照。HE觀察組織中細胞是否排列整齊，組織間隙是否發(fā)生炎性浸潤。Masson染色觀察組織間隙是否發(fā)生纖維化。每張切片在顯微鏡（200倍）下選取3個視野，使用Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計炎性浸潤，纖維化和整個組織切片的面積。炎性浸潤和纖維化百分比為炎性浸潤和纖維化面積與組織切片面積的比值，取3個視野的平均值。

1.5 Western蛋白質印跡法檢測HCN4和NCX1蛋白表達

取組織30 mg，加入RIPA裂解液，剪碎，放入勻漿器中磨碎，冷凍離心（12000×g，4℃，15 min）。BCA法測定蛋白質濃度。各樣品組織加入等量的5×SDS加樣緩沖液均勻混合，煮沸5 min，使蛋白質充分變質。采用10%SDS-PAGE分離蛋白質，120 V，60 min轉膜。將轉好的PVDF膜置于封閉液（5%脫脂奶粉TBST混合液）中1 h，取出PVDF膜于TBST中洗凈，進行一抗（GAPDH：1∶5000，HCN4：1∶5000，NCX1：1∶3000）孵育，4℃過夜。用TBST溶液洗膜，重復3次，每次10 min。二抗（1∶5000）室溫孵育2h。TBST重復洗膜3次，每次10min。最后加入ECL顯色劑后放入Bioshine Chemi Q4600mini化學發(fā)光成像儀中顯影，Chemi Capture軟件拍照成像，用Image J圖像分析軟件進行分析。目標蛋白相對表達水平用積分吸光度（integrated absorbance，IA）目標蛋白/IAGAPDH比值表示。

1.6 統(tǒng)計學分析

本研究采用SPASS 11.0系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗結果數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 右冠狀動脈結扎對SD大鼠心電圖的影響

SD大鼠心電圖結果顯示（圖1），與正常組大鼠心電圖相比，假手術組無明顯改變，左、右冠狀動脈結扎組大鼠ST段升高。對ST段進行分析，結果顯示（圖1B），與假手術組相比，左、右冠狀動脈結扎均可引起大鼠心電圖ST段顯著升高（P＜0.01）；但右冠狀動脈結扎組大鼠ST段升高較左冠脈動脈結扎大鼠ST段上升幅度?。≒＜0.01），提示右冠狀動脈結扎導致大鼠右心房缺血程度較輕。

2.2 右冠狀動脈結扎對SD大鼠心率的影響

結果顯示（圖2），假手術組大鼠實驗過程中心率平穩(wěn)，無較大波動；左冠狀動脈結扎組大鼠心率在術后d5上升（P＜0.05），術后d15回落至正常水平；右冠狀動脈結扎組大鼠，在術后d10心率顯著降低（P＜0.05）。提示右冠狀動脈結扎可誘導大鼠心動過緩，導致心率顯著降低。

2.3 右冠狀動脈結扎對SD大鼠心功能的影響

心功能結果顯示（圖3），與假手術組相比，左冠狀動脈結扎組SD大鼠的-dp/dtmax顯著下降（P＜0.01），LVEDP顯著上升（P＜0.01）。右冠狀動脈結扎組SD大鼠上述參數(shù)無顯著差異,提示右冠狀動脈結扎未造成SD大鼠心功能受損。提示右冠狀動脈結扎并未通過損傷大鼠心功能導致心率降低。

2.4 右冠狀動脈結扎對SD大鼠右心房組織形態(tài)的影響

組織形態(tài)學實驗結果顯示（圖4），左、右冠狀動脈結扎SD大鼠的右心房都有較為明顯的炎癥浸潤（HE染色）和纖維化變化（Masson染色），說明2種結扎方法均可引起SD大鼠右心房組織形態(tài)改變。對炎性浸潤（圖4A白色區(qū)域）和纖維化（圖4A藍色區(qū)域）區(qū)域面積進行統(tǒng)計，結果顯示（圖4B和4C），與左冠狀動脈結扎組相比，右冠狀動脈結扎組SD大鼠炎性浸潤（P＜0.01）和纖維化（P＜0.01）變化更明顯，提示右冠狀動脈結扎對SD大鼠右心房損傷更嚴重。

Fig.1 Representative traces of electrocardiogram（ECG）after coronary artery ligations.Eighteen male SD rats were divided into left anterior descending（LAD）ligation group，right marginal branch of right coronary artery（RMA）ligation group，and sham-operated group.Chests of six rats per group were opened after being anesthetized with 10%chloral hydrate（ip，300 mg · kg-1）.Then LAD and RMA were ligated while moni?tored.The ECG was recorded on the 5thday(d5)，d10 and d15 after surgery.B was quantitative analysis of ST segment in A.Arrows in A show ST segments were elevated obviously in LAD ligation group and slightly in RMA ligation group,respectively.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with RMA ligation group.

Fig.2 Effect of LAD and RMA ligation on heart rate from d0 to d15.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with d0 after surgery.

Fig.3 Effect of LAD and RMA ligation on maximal rate of decline of ventricular pressure（-dp/dtmax）（A），maximal rate of rise of ventricular pressure（+dp/dtmax）（B），left ventricular end-diastolic pressure（LVEDP，C）and left ventricular systolic pressure（LVSP，D）on d16 after surgery.See Fig.1 for the rat treatment.1 mmHg=0.133 kpa.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with sham group.

Fig.4 Histopathological changes on auricula dextra of rats by HE and Masson staining.See Fig.1 for the rat treatment.B：quantitative result of fibrosis in A；C：quantitative result of inflammatory cells infiltration in A.The arrows indicate inflammatory cell infiltration and fibrosis.± s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with LAD ligation group.

2.5 右冠狀動脈結扎對大鼠竇房結起搏相關通道蛋白表達的影響

Western蛋白印跡結果顯示（圖5），與假手術組相比，左冠狀動脈結扎組SD大鼠的HCN4和NCX1蛋白表達水平無明顯改變，右冠狀動脈結扎組SD大鼠HCN4和NCX1蛋白表達水平顯著性降低（P＜0.05）,提示右冠狀動脈結扎可抑制SD大鼠HCN4和NCX1蛋白的表達。

Fig.5 Sodium calcium exchanger 1（NCX1）and hyper?polarization activated cyclic nucleotide gated cation channel 4（HCN4）protein expression after surgery by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.IA：integrated absorbance.B was semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with sham group.

3 討論

竇房結是哺乳動物心臟正常節(jié)律的起搏點。竇房結由4種細胞組成：具有起搏功能的P細胞，過渡細胞（T細胞），浦肯野細胞以及普通心肌細胞。竇房結細胞4期自動除極速率是心臟自律性的基礎，主要由HCN、NCX、L型Ca2+通道、T 型Ca2+通道和Na+-K+泵等參與［10］。其中L型和T 型Ca2+通道及Na+-K+泵已有許多研究者進行了大量研究。本研究以NCX和HCN為研究對象，觀察其在心動過緩模型中的改變。NCX在動作電位4相，可通過調(diào)節(jié)胞外Ca2+內(nèi)流，協(xié)助自動除極而影響心率［11］。NCX1是心臟NCX的主要亞型。HCN在竇房結細胞中選擇性地高密度分布，激活后可使竇房結起搏細胞去極化，引起膜電位逐漸升高至接近閾值，從而產(chǎn)生周而復始的電活動。與HCN相關的門控通道亞單位主要有HCN1，HCN2和HCN4，在竇房結起搏通道中占主要支配的成分是HCN4亞型［12］。起搏電流（funny current，I）f是HCN陽離子電流，由Na+和K+混合而成，主要在竇房結細胞的舒張去極化的早期起除極的作用，HCN4含量的減少導致If減弱，Na+內(nèi)流減少，嚴重阻礙了起搏細胞自動去極化的速度，減慢大鼠心率。竇房結細胞的去極化早中期的Ca2+內(nèi)流促進肌漿網(wǎng)蘭尼堿受體的局部Ca2+釋放，觸發(fā)INCX，INCX以排出1個Ca2+和轉入3個Na+的正向模式形成內(nèi)向電流，降低膜電位負值達閾電位水平約-40 mV時，激活ICa-L，大量Ca2+內(nèi)流通過Ca2+誘導的Ca2+釋放激發(fā)全細胞肌漿網(wǎng)鈣釋放至胞質形成鈣瞬變，產(chǎn)生動作電位的上升支。NCX1含量降低，使Ca2+內(nèi)流減少，緩慢形成動作電位上升支，動作電位周期延長，導致心率降低。

冠狀動脈右分支是右心房供血的重要來源之一，結扎SD大鼠右冠狀動脈分支，右心房供血受損，竇房結供血不足。左冠狀動脈分支是左心室的主要供血來源，左冠狀動脈結扎，心室供血障礙，可引起心功能嚴重受損。實驗結果顯示，結扎左、右冠狀動脈，心電圖ST段均升高，提示結扎成功，均造成心臟缺血損傷。竇房結主要由右冠狀動脈供血，右冠狀動脈結扎導致竇房結供血不足，使得竇房結細胞損傷，易引發(fā)心動過緩。ST段升高幅度顯示，右冠狀動脈結扎引起的心臟缺血程度顯著低于左冠狀動脈結扎，說明右冠狀動脈結扎對心臟的損傷較輕，有利于提高SD大鼠存活率。對SD大鼠心率進行統(tǒng)計，結果顯示右冠狀動脈結扎10 d后，SD大鼠心率明顯降低，且術后15 d心率保持較低水平，說明右冠狀動脈結扎成功誘導了SD大鼠心動過緩，并且我們認為右冠狀動脈結扎10～15 d，是建立心動過緩模型比較合適的時間。為了排除SD大鼠心功能對心率的影響，術后15 d，對SD大鼠進行了血流動力學指標的檢測，結果顯示，左冠狀動脈結扎組SD大鼠-dp/dtmax顯著降低，LVEDP顯著升高，提示心功能明顯受損。此結果與張穎等［13］左冠狀動脈結扎實驗結果一致。右冠狀動脈結扎組SD大鼠的主要血流動力學指標（-dp/dtmax，+dp/dtmax，LVEDP和LVSP）與對照組數(shù)值無明顯差異。因此猜測，左冠狀動脈結扎未能引起心率降低，術后出現(xiàn)的心率升高，估計與心室供血障礙引起心功能降低，反饋性心率變化所致。右冠狀動脈結扎對左心室功能影響小，心率的平穩(wěn)降低可能與右心房缺血性損害有關。為此進行了SD大鼠右心房組織形態(tài)學檢查，結果顯示，右冠狀動脈結扎SD大鼠右心房組織纖維化程度比左冠狀動脈結扎組明顯增高，炎癥浸潤更為嚴重。心房纖維化可引起心肌細胞靜息電位超極化，抑制細胞興奮，引起心率降低。右心房損傷使得竇房結細胞受損，誘發(fā)心動過緩。Western蛋白質印跡實驗結果進一步證實，與對照組相比，右冠狀動脈結扎組SD大鼠的右心房組織（包含竇房結）中HCN4和NCX1蛋白表達顯著降低而左冠狀動脈結扎組SD大鼠上述蛋白表達無明顯改變。宋寶瑩［14］研究報道，右冠狀動脈動脈粥樣硬化管腔狹窄可導致HCN4表達降低，左冠狀動脈粥樣硬化和心肌梗死與HCN4表達無關，與本實驗結果一致。HCN4和HCN1是竇房結細胞維持自律性的重要離子通道，其表達減少，阻礙起搏細胞自動除極且延長動作電位周期，誘發(fā)心動過緩。

與經(jīng)典的左冠狀動脈結扎術相比，右冠狀動脈結扎術對SD大鼠心臟功能影響較小，交感神經(jīng)反饋性刺激較弱，心率變化平穩(wěn)，竇房結缺血性病變和纖維化明顯，手術操作難度與左冠狀動脈結扎類似。為保證結扎部位和程度類似，右冠狀動脈結扎操作時要把心臟取出，置于胸腔外，因此實驗操作和飼養(yǎng)環(huán)境應盡可能潔凈，SD大鼠胸部主要消毒和無菌處理，必要時使用抗菌藥物，避免SD大鼠傷口感染，操作要盡可能輕柔、迅速，避免損傷血管及其他器官。

與現(xiàn)有的心動過緩模型相比，SD大鼠右冠狀動脈結扎建立的心動過緩模型的發(fā)病機制和缺血性病竇綜合征類似，都是由于冠狀動脈阻塞，引起竇房結供血不足，導致竇房結損傷，引發(fā)心律失常。同時，成模時間短，約2周。此模型可用于動態(tài)研究缺血對竇房結功能的影響和心房纖維化與缺血的關系。對探討心動過緩發(fā)病機制，觀察心動過緩治療藥物的療效，以及尋找心動過緩藥物治療靶點，此模型都有廣泛的應用價值。