梁雪雪，劉鵬飛，譚李倩，李明，趙微

（錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001）

人星狀病毒（human astrovirus，HAstV）為無囊膜、單股、正鏈RNA病毒，是導(dǎo)致嬰幼兒、老人及免疫缺陷人群腹瀉的重要病原體[1]。HAstV具有8個傳統(tǒng)的血清型（HAstV 1～8），其中HAstV-1型在全世界范圍內(nèi)廣泛流行[2]。目前，國內(nèi)HAstV的研究報道局限在流行病學(xué)分析，有關(guān)病毒的分離方法及生物學(xué)特性報道較少。本文對HAstV-1型野毒株進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定，為后續(xù)深入研究星狀病毒的分子致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

Caco-2細(xì)胞（美國ATCC細(xì)胞庫），35份腹瀉患兒糞便樣本來源于遼寧省某市私立幼兒園群體腹瀉樣本，并由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Cell Culture Companion，美國Gibco公司），HAstV抗體（8E7）為小鼠單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司），HAstV、輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 檢測試劑盒購自丹麥Dako Diagnostics公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、豬胰酶及胰酶抑制劑購自美國Sigma-ALDRICH公司和中國上海分公司；病毒RNA抽提試劑盒（德國Qiagene公司），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）相關(guān)分子生物學(xué)試劑購自大連寶生生物工程公司有限公司，基因測序由上海杰李生物測序公司完成。

1.3 HAstV的鑒定

糞便樣本經(jīng)過PBS漩渦離心處理后取上清液作為第一代野毒株P(guān)1，采用ELISA試劑盒檢測樣本中HAstV、輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒。提取病毒RNA，采用病毒的特異性引物分別對HAstV、輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒進(jìn)行RT-PCR定性檢測，引物序列參考文獻(xiàn)[3-4]。

1.4 HAstV在Caco-2上的擴(kuò)增及適應(yīng)性培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞接種于6孔板，長至單層，取500μl HAstV P1代野毒株上清液，加入豬胰酶（終濃度100～200μg/ml），于37℃激活60～90 min后，加入同量的豬胰酶抑制劑。病毒加入細(xì)胞前，細(xì)胞饑餓培養(yǎng)4 h，將病毒液加入細(xì)胞表面吸附60～90 min后，棄去病毒，用PBS洗2次，加入無血清培養(yǎng)基DMEM持續(xù)培養(yǎng)，96 h后用細(xì)胞刮刀收集所有細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，-70℃凍存。感染后的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過3次反復(fù)凍融后，使病毒釋放，4℃離心，棄細(xì)胞碎片，收集上清液作為第2代病毒（P2）進(jìn)行擴(kuò)增。按照上述方法經(jīng)過10次（P1～P10）擴(kuò)增傳代及適應(yīng)性培養(yǎng)。

1.5 qRT-PCR

采用SYBR染料法檢測每一代次HAstV的拷貝數(shù)。HAstV正向引物：5-CCGAGTAGGATCGAG GGT-3，HAstV反向引物：5-GCTTCTGATTAAATCAAT TTTAA-3，擴(kuò)增HAstV衣殼蛋白ORF2特異性基因，擴(kuò)增產(chǎn)物88 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，采用核酸分光光度計檢測質(zhì)粒濃度，并根據(jù)公式基因拷貝數(shù)/（copies/ml）=（6.02×1023/mol×質(zhì)粒濃度g/ml）/分子量（MWg/mol），計算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)，建立DNA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個樣本重復(fù)3次，以Ct值為橫坐標(biāo)，以log基因拷貝數(shù)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用qRT-PCR儀（BIORAD IQ5）對病毒基因拷貝數(shù)進(jìn)行測定。

1.6 免疫熒光法

采用免疫熒光法檢測病毒抗原。將Caco-2細(xì)胞接種于6孔板，取第6代病毒液（P6）按照上述方法感染細(xì)胞，采用4%多聚甲醛固定，經(jīng)過打孔、封閉后，一抗加入HAstV 8E7抗體（1∶1 000，8E7為小鼠單克隆抗體），二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體（1∶500）。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)HAstV熒光灶。

1.7 病毒基因穩(wěn)定性檢測

分別提取P1～P10代病毒液RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后，采用PCR方法擴(kuò)增HAstV衣殼蛋白特異性基 因ORF2。ORF2正 向 引 物 ：5-ATGGCTAGCAA GTCCAATAAGCA-3，ORF2反向引物：5-CTACTCGG CGTGGCCGCGGCTTCC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物2 364 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳檢測，回收純化，構(gòu)建到PMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送上海杰李生物測序公司測序。

1.8 熒光灶法

采用熒光灶法檢測病毒滴度。將Caco-2細(xì)胞按1×104個/ml的密度接種于96孔板，再加入10倍系列稀釋的病毒感染細(xì)胞上清（50μl/孔），按照1.4中的方法感染細(xì)胞，96 h后棄去病毒液，加入4%多聚甲醛4℃固定30 min；棄去固定液，加入抗HAstV熒光抗體8E7（1∶1 000稀釋）50μl/孔，37℃中和1 h；PBS清洗后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶500），37℃孵育1 h，PBS沖洗后，在熒光顯微鏡下觀察，計算終末稀釋孔熒光灶個數(shù)，并計算病毒滴度。病毒滴度（FFU/ml）=（最高稀釋倍數(shù)孔熒光灶個數(shù)的平均值+相鄰較低稀釋倍數(shù)孔熒光灶個數(shù)的平均值）/2×相鄰較低稀釋倍數(shù)×每孔加入的病毒稀釋液的體積。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

繪制qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，基因拷貝數(shù)取Log對數(shù)作為因變量，Ct值作為自變量，應(yīng)用直線回歸法。

2 結(jié)果

2.1 HAstV的定性結(jié)果

35份腹瀉樣本經(jīng)過PBS處理后ELISA結(jié)果表明，HAstV感染率為85.7%（30/35），未檢出其他病毒的感染。RT-PCR檢測結(jié)果表明，HAstV檢出率為100%。將所有樣本進(jìn)行基因測序，結(jié)果檢測出15株HAstV（GenBank No.KF211460–KF211474），經(jīng)過序列分析對比及遺傳進(jìn)化分析，確認(rèn)分離的毒株屬于HAstV-1d亞型[5]。本研究中選取其中1株毒株編號JZ-10作為P1代野毒株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 HAstV的適應(yīng)性培養(yǎng)、增殖及抗原檢測結(jié)果

HAstV JZ-10接種Caco-2細(xì)胞傳代到第10代，未觀察到明顯的細(xì)胞病變。但通過免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)的病毒感染情況，表明JZ-10毒株在Caco-2細(xì)胞連續(xù)傳10代，在接種病毒的細(xì)胞內(nèi)均檢測到明亮的綠色病毒特異性熒光，而對照組細(xì)胞內(nèi)未見綠色熒光（以第6代病毒為例）（見圖1）。表明HAstV已經(jīng)適應(yīng)在Caco-2內(nèi)的復(fù)制，且具有良好的抗原性。毒株適應(yīng)細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件為：毒株感染前加入終濃度為200μg/ml的豬胰酶，于37℃激活90 min后再加入同量的豬胰酶抑制劑。激活的病毒液加入細(xì)胞表面吸附90 min后，棄去病毒，維持培養(yǎng)液中不加血清，維持培養(yǎng)96 h后收取全部細(xì)胞及上清液。經(jīng)過3次反復(fù)凍融使病毒釋放，4℃離心，棄去細(xì)胞碎片，收集上清液作為下一代病毒。

圖1 JZ-10毒株P(guān)6代感染Caco-2細(xì)胞 （免疫熒光×20）

2.3 細(xì)胞內(nèi)HAstV的拷貝數(shù)

采用HAstV熒光定量引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)88 bp的目的片段，回收目的片段克隆測序進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示該片段與HAstV-1ORF2基因相似性為100%。建立標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PMD18-T-ORF2，質(zhì)粒濃度458.3μg/ml。根據(jù)公式計算出質(zhì)粒的基因拷貝數(shù)為1.5×1011copies/ml。質(zhì)粒按照10倍梯度稀釋后行qRT-PCR檢測，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果繪制Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線，log基因拷貝數(shù)=-0.3141（Ct）+13.87，決定系數(shù)R2=0.997，Tm值（85±0.05）℃（見圖2）。JZ-10毒株基因拷貝數(shù)結(jié)果見附表，隨著病毒傳代次數(shù)的增加，HAstV的拷貝數(shù)增加，P9代和P10代達(dá)最高峰，基因拷貝數(shù)達(dá)1×107。

圖2 qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

附表 HAstV JZ-10毒株基因拷貝數(shù)

2.4 HAstV特異性基因穩(wěn)定性鑒定結(jié)果

提取P1～P10培養(yǎng)物的RNA，采用RT-PCR擴(kuò)增HAstV衣殼蛋白全長基因ORF2，同時設(shè)立陰性對照組和陽性對照組。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見2 364 bp的特異性基因片段（見圖3）。經(jīng)過測序分析，P1～P10代基因序列一致，無突變現(xiàn)象，基因序列穩(wěn)定。

圖3 HAstV衣殼蛋白全長基因ORF2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.5 HAstV的感染滴度

HAstV-1型JZ-10株在Caco-2細(xì)胞上連續(xù)傳10代，病毒的感染性滴度呈持續(xù)升高直至穩(wěn)定適應(yīng)過程，第1、2代病毒滴度最低，傳至第3代時，病毒的感染性滴度開始增加，達(dá)3.3 logFFU/ml；至第9、10代，病毒滴度最高，達(dá)6.97 LogFFU/ml（見圖4）。

圖4 HAstV-1型JZ-10毒株不同代次感染性滴度

3 討論

小兒腹瀉是全球性的重要公共衛(wèi)生問題之一，除輪狀病毒、杯狀病毒和腺病毒以外，HAstV是也一個引起兒童病毒性腹瀉的重要致病因子[6]。近10年來，我國嬰幼兒感染HAstV的檢出率逐年增加；2010年，國內(nèi)幼兒園及產(chǎn)科病房新生兒HAstV感染性腹瀉的爆發(fā)引起兒科的高度重視[7]。HAstV與其他腸道病毒，如諾如病毒、輪狀病毒、腺病毒等混合感染，延長患者的治愈周期，增加患者的死亡率，已成為公共衛(wèi)生問題[8]。本實(shí)驗(yàn)分析HAstV-1型毒株在Caco-2細(xì)胞上的適應(yīng)性及毒株的生物學(xué)特性，為后續(xù)研究病毒的分子生物學(xué)機(jī)制及疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

HAstV具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，由于病毒感染細(xì)胞后，沒有明顯的細(xì)胞病變，因此給病毒的分離培養(yǎng)及滴度檢測帶來困難。本課題組前期在幼兒園腹瀉群體樣本中分離出1株HAstV-1型，根據(jù)病毒的生物學(xué)特性，進(jìn)行病毒分離與細(xì)胞的適應(yīng)性培養(yǎng)。文獻(xiàn)報道，Caco-2細(xì)胞能夠支持HAstV株的復(fù)制和感染，已成為研究HAstV感染的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系[9]。一些腸道病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)時都需要胰酶的存在，如小兒輪狀病毒[10]。本文實(shí)驗(yàn)最終采用終濃度為200μg/ml的豬胰酶，于37℃激活90 min后進(jìn)行病毒感染，在細(xì)胞的傳代過程中，每次接種病毒都要進(jìn)行胰酶的激活處理，胰酶的活性作用可以使病毒粒子激活，形成具有感染性的病毒粒子，并能夠維持病毒在細(xì)胞內(nèi)具有一定的感染滴度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JZ-10毒株經(jīng)過10代的細(xì)胞適應(yīng)性培養(yǎng)后，雖然未出現(xiàn)可見的CPE，但是免疫熒光檢測結(jié)果提示，HAstV已經(jīng)適應(yīng)在Caco-2內(nèi)的復(fù)制，在無血清DMEM維持培養(yǎng)時，細(xì)胞不脫落，免疫熒光檢測病毒能夠識別HAstV單克隆抗體，具有良好的抗原性。而本實(shí)驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，該細(xì)胞的功能和分泌與小腸上皮細(xì)胞類似，并能夠形成隱窩結(jié)構(gòu)，因此HAstV感染Caco-2后的致病作用與天然病毒感染類似。

病毒滴度測定是HAstV在后續(xù)研究實(shí)時處理因素中的重要步驟。目前測定病毒滴度的方法有多種，一類是對病毒粒子進(jìn)行物理定量；一類是生物學(xué)方法，如空斑滴定法、50%細(xì)胞組織感染法、免疫熒光法等。由于HAstV感染細(xì)胞后不能觀察到明顯的細(xì)胞病變，因此本實(shí)驗(yàn)采用微量免疫熒光灶法測定病毒滴度，通過HAstV一抗孵育，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗雜交，利用熒光顯微鏡觀察發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量，判斷細(xì)胞的感染量。該方法有效檢測出HAstV的滴度，隨著傳代次數(shù)的升高，病毒滴度增加，病毒感染滴度可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。同時本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR對病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖情況進(jìn)行檢測，病毒的基因拷貝數(shù)能夠反映病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況和宿主細(xì)胞的感染性。該方法能夠較為精確地反映病毒中的病毒顆粒數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，病毒的基因拷貝數(shù)與病毒的滴度呈正相關(guān)，且隨著傳代次數(shù)增加，病毒基因組保持穩(wěn)定。

通過本實(shí)驗(yàn)HAstV的適應(yīng)性培養(yǎng)與增殖研究，獲得能夠在實(shí)驗(yàn)室中分離培養(yǎng)的細(xì)胞適應(yīng)性HAstV-1毒株，該毒株的獲得為后續(xù)進(jìn)行HAstV的研究奠定了基礎(chǔ)。