穆拉迪力·約麥爾，納菲沙·卡德爾，阿卜力孜·克熱木，夏米西努爾·伊力克

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054）

卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）指＜40歲女性因某種原因引起原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)、卵泡生成受阻等卵巢整體功能受損[1-3]。中醫(yī)認(rèn)為，在婦科病“外邪入侵”的眾多致病因素中，寒、濕、熱邪為主要原因，能夠傷及中焦陽氣，最終引起經(jīng)絡(luò)不通、水液代謝異常[4]。SRB1蛋白在膽固醇代謝平衡中起關(guān)鍵作用，卵巢組織中SRB1的異常表達(dá)導(dǎo)致體內(nèi)膽固醇代謝異常。CYP2E1基因表達(dá)上調(diào)引起細(xì)胞毒素代謝增加，導(dǎo)致活性氧大量合成，最終卵巢功能受損[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

通過陰道涂片篩選法（發(fā)情周期實驗）選取性成熟的50只健康Wistar雌性大鼠（由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體重（180±30）g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，由于理論造模時間相差較大，隨機分為POF組（A組）、熱邪復(fù)合應(yīng)激模型組（B組）、正常對照第1組（N1組），以及寒邪復(fù)合應(yīng)激模型組（C組）、正常對照第2組（N2組）。各組10只大鼠。A組、B組、N1組模型復(fù)制時間10 d；C組、N2組模型復(fù)制時間21 d。

1.2 主要試劑及儀器

RXZ型人工氣候箱（寧波市新江南儀器有限公司），兔多克隆抗體CYP2E1、兔單克隆抗體SRB1購自美國Abcam公司，順氯氨鉑（美國Sigma公司），大麥、芫荽籽、黑胡椒、干姜、西紅花。

1.3 方法

1.3.1 POF大鼠模型的復(fù)制 按照LI等[6]的方法，將1.5 mg/kg順氯氨鉑稀釋于1 ml生理鹽水，每天下午2：00行腹腔注射，連續(xù)10 d。在（20±3）℃、相對濕度（relative humidity, RH）55%～65%條件下飼養(yǎng)大鼠。

1.3.2 中醫(yī)寒邪復(fù)合應(yīng)激致POF動物模型的復(fù)制 在楊宇琦等[7]報道的模型基礎(chǔ)上做適當(dāng)調(diào)整，采用干寒飼養(yǎng)環(huán)境[人工氣候箱：（6±2）℃、RH 25%～35%，12 h/次，1次/d]，干寒屬性飼料（大麥、芫荽籽）飼養(yǎng)。同時予以間斷性足底電刺激、制動，冷水中強迫游泳等多因素復(fù)合作用，產(chǎn)生慢性應(yīng)激，持續(xù)3周。

1.3.3 中醫(yī)熱邪復(fù)合應(yīng)激致POF動物模型的復(fù)制

按照中醫(yī)“熱邪”證候特點[8]，結(jié)合寒邪模型復(fù)制方法，采用干熱飼養(yǎng)環(huán)境[人工氣候箱：（26±2）℃、RH 25%～35%，12 h/次，1次/d]，干熱屬性飲水（1 g西紅花浸泡于500 ml雙蒸水），干熱屬性藥物灌胃（30.0 g黑胡椒、30.0 g干姜、0.3 g西紅花溶解于500 ml雙蒸水，按2 ml/100 g體質(zhì)量灌胃，1次/d）。同時予以間斷性足底電刺激、夾尾、噪音等多因素復(fù)合作用，產(chǎn)生體內(nèi)刺激，持續(xù)10 d。

1.3.4 正常對照組 大鼠在（20±3）℃、RH 55%～65%條件下飼養(yǎng)，自由飲食。各組大鼠12 h晝/夜循環(huán)照明，定時觀測生物學(xué)表征變化。

1.3.5 觀察指標(biāo) 模型復(fù)制成功后用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，取卵巢組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片。

1.3.6 免疫組織化學(xué)法 每個樣本隨機選取10個視野，并保證各視野間完全不重疊。采用陽性細(xì)胞計數(shù)法，每組取7～10個不同樣本，進(jìn)行組間比較。陽性范圍指陽性細(xì)胞所占百分率，分為5個等級：陽性范圍＜5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；著色強度指陽性細(xì)胞染色程度，分為4個等級：幾乎不著色或有一點著色為0分，著色較淺為1分，著色較深為2分，著色很深為3分，最終得分=陽性范圍評分×著色強度評分×25。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠SRB1蛋白表達(dá)水平比較

SRB1蛋白在卵巢組織的黃體細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)，在細(xì)胞核和顆粒層細(xì)胞中呈陰性表達(dá)。N1組、N2組、A組、B組、C組大鼠的SRB1蛋白相對表達(dá)量分別為（92.86±34.50）、（97.22±44.10）、（246.88±73.72）、（200.00±35.36）、（182.14±40.09），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.734，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，各模型組卵巢組織中SRB1蛋白表達(dá)水平較正常對照組升高（P＜0.05）；其中A、B組較N1組卵巢組織中SRB1蛋白表達(dá)變化率分別為166%和115%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；C組較N2組卵巢組織中SRB1蛋白表達(dá)變化率為87%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；A組與B組、A組與C組卵巢組織中SRB1蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組與C組卵巢組織中SRB1蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、2。

圖1 SRB1在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá) （×100）

圖2 各組大鼠卵巢組織中SRBI表達(dá)水平比較 （±s）

2.2 各組大鼠CYP2E1蛋白表達(dá)水平比較

CYP2E1蛋白在卵巢組織的黃體細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、顆粒層細(xì)胞、細(xì)胞漿中呈陽性表達(dá)，在卵泡間質(zhì)細(xì)胞中呈陰性表達(dá)。N1組、N2組、A組、B組、C組大鼠的CYP2E1蛋白相對表達(dá)量分別為（106.25±60.87）、（108.33±43.30）、（265.63±64.00）、（201.00±35.36）、（182.14±104.80），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.198，P=0.001）進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，各模型組卵巢組織中CYP2E1表達(dá)水平較正常對照組升高（P＜0.05）；其中A、B組較N1組卵巢組織中CYP2E1蛋白表達(dá)變化率分別為150%和89%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；C組較N2組卵巢組織中CYP2E1蛋白表達(dá)變化率為68%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組與B組、A組與C組卵巢組織中CYP2E1蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組與C組卵巢組織中CYP2E1蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 3、4。

圖3 CYP2E1在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá) （×100）

圖4 各組大鼠卵巢組織中CYP2E1表達(dá)水平比較 （±s）

3 討論

隨著社會快速發(fā)展，引起POF的因素諸多，包括遺傳因素、自身免疫、感染情況等[9]。由于POF病因復(fù)雜，尚無有效的治療方法。西醫(yī)多采用激素替代療法（hormone replacement therapy, HRT）和促排卵療法，即給予相應(yīng)激素以補充機體雌激素不足[10-11]。HRT療法具有療程長、毒副作用強等特點，使患者患心臟病、子宮內(nèi)膜癌等惡性疾病的風(fēng)險加大。中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為，腎虛是POF的病理學(xué)基礎(chǔ)，病變涉及心、肝、脾、肺等器官，肺臟在婦科疾病的診療中經(jīng)常被忽略，但肺與腎組織關(guān)系密切，肺陰虛損，亦可致腎陰不足。由于中醫(yī)實驗動物研究起步晚，不同中醫(yī)體質(zhì)異常所致的POF動物模型尚未成功復(fù)制，其生物學(xué)基礎(chǔ)與發(fā)病機制需進(jìn)一步從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度進(jìn)行研究。

SRB1是位于細(xì)胞表面的一種受體糖蛋白，分布廣泛，主要在肝臟、腎上腺、卵巢等能生成類固醇激素的組織中高度表達(dá)。SRB1可以結(jié)合未被修飾過的LDL、VLDL等配體，對HDL有高親和力，在HDL代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在細(xì)胞外膜上，SRB1能夠調(diào)節(jié)疏水脂蛋白中脂類物質(zhì)的選擇性攝取，既能介導(dǎo)肝臟對HDL中膽固醇脂的選擇性攝取，又能促進(jìn)外周組織細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)運至HDL，從而保持膽固醇代謝的平衡[12]。因此，POF的發(fā)生可能與體內(nèi)膽固醇代謝有關(guān)，膽固醇代謝異?？赡苁菬嵝啊⒑皩?dǎo)致POF的原因。CYP2E1是CYP450酶系中重要的亞型，在乙醇代謝中起關(guān)鍵作用。在高濃度乙醇條件下，隨著CYP2E1蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞毒素代謝增加，產(chǎn)生大量活性氧，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。CYP2E1升高還可引起炎癥反應(yīng)加重，可以級聯(lián)引發(fā)其他炎癥因子的活性升高，促進(jìn)其他炎癥因子表達(dá)。POF的發(fā)生還可能與細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)、活性氧，以及炎癥因子的過度產(chǎn)生有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，SRB1、CYP2E1蛋白在POF，以及熱邪、寒邪復(fù)合應(yīng)激模型大鼠卵巢組織中的表達(dá)水平有不同程度變化，POF組表達(dá)最高，其次為熱邪和寒邪復(fù)合應(yīng)激大鼠模型組，模型組與正常對照組有差異。寒邪、熱邪復(fù)合應(yīng)激模型與POF的發(fā)生關(guān)系密切。熱邪、寒邪所致POF可能與體內(nèi)膽固醇代謝異常及活性氧等物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。