張宇，孫淑嫻，馬威，李昌義，王斌，王兆祥，亢小麗，紀征

（河北省唐山工人醫(yī)院 心內(nèi)一科，河北 唐山 063000）

冠狀動脈疾病通過經(jīng)皮冠狀動脈介入治療，雖然可以改善患者的心肌血流灌注，但是術后再狹窄成為主要臨床問題。由于術后受損血管的自我修復，導致炎癥的發(fā)生、血管平滑肌細胞增殖并向內(nèi)膜遷移，從而使血管內(nèi)膜增厚及再狹窄發(fā)生[1]。有研究表明，Toll樣受體TLR4（toll-like receptor, TLR4）與核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor kappa B, NF-κB）信號通路參與受損血管內(nèi)膜增生[2-4]。因此阻斷TLR4/NF-κB表達，可有效抑制炎癥反應、減輕細胞增殖、防止術后再狹窄。蛇床子素為香豆素化合物，常見于蛇床、當歸等傘形科中藥材，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、改善記憶等藥理作用[5-6]。本研究采用大鼠頸動脈內(nèi)皮損傷的模型，予以蛇床子素后，觀察其對血管內(nèi)膜和平滑肌細胞增殖的影響，并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

蛇床子素（中國藥品檢驗所，純度＞98%），小鼠增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體、DyLight 594紅色熒光二抗購自美國Santa Cruz公司，BSA封閉液、DAB顯色試劑盒、TBST緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液購自北京索萊寶生物技術有限公司，TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自大連凡邦生物科技有限公司，切片機（德國Leica公司CM1900），自動染色機（德國Leica公司AUTOSTAINERXL），自動封片機（德國Leica公司CV5030），光學顯微鏡（日本Olympus公司BX51），病理圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 動物模型的復制與分組

1.2.1 大鼠頸動脈球囊損傷模型的復制 SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，頸正中線切口，通過頸外靜脈注射肝素鈉（100 u/kg），夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈遠心端，進而阻斷血流。于頸外動脈遠心端處，剪出斜形切口，在頸外動脈切口處將導引鋼絲和PTCA球囊導管（l.5 mm×20.0 mm）逆行插入頸總動脈，距頸外動脈分叉處2.5 cm，向球囊內(nèi)注入生理鹽水直至球囊充盈，抽動并旋轉(zhuǎn)球囊，從而剝脫內(nèi)膜。假手術組不插入球囊導管，其余各組平行操作。給藥干預16 d后處死所有動物，分離左頸總動脈進行實驗[7]。

1.2.2 實驗動物分組 健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，由北京大學實驗動物學部提供。實驗動物隨機分為4組：①假手術組；②模型組：頸動脈球囊損傷組+0.9% NaCl；③低劑量蛇床子素組：頸動脈球囊損傷+10 mg/（kg·d）蛇床子素，1次/d；④高劑量蛇床子素組：頸動脈球囊損傷+30 mg/（kg·d）蛇床子素，1次/d。

1.3 蘇木精-伊紅染色法

采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜的病理變化，通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測量各組血管內(nèi)膜和中膜面積比（intima/media，I/M）[8]。

1.4 免疫組織化學法熒光染色

采用免疫組織化學法檢測斑塊內(nèi)PCNA[9-10]，組織切片脫蠟后，抗原修復15 min，一抗4℃孵育過夜，熒光二抗37℃避光孵育40 min，PBS漂洗，中性樹膠封片。每張切片隨機觀察3個不同視野，計算PCNA陽性表達指數(shù)，PCNA陽性表達指數(shù)=PCNA陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.5 ELISA

采用ELISA檢測損傷血管TNF-α和IL-1β水平。受損血管預冷PBS洗滌，濾紙吸干水分，加入RIPA裂解液后，在冰水中充分研磨5 min，低溫高速離心機4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-1β水平。

1.6 Western blot檢測

收集各組血管，PBS洗2次，用蛋白裂解液在冰上研磨血管3 min，提取蛋白，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白濃度，配平各組蛋白濃度，蛋白變性，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，NF-κB p65（1∶500）或TLR4（1∶200）4℃冰箱過夜，棄一抗，TBST洗膜3次，5 min/次；將膜轉(zhuǎn)入雜交袋，室溫孵育二抗（1∶5 000）2 h，棄二抗，TBST洗膜3次，5 min/次；ECL系統(tǒng)顯影，采用β-actin作為內(nèi)參，計算相對灰度值，實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血管結構的改變

大鼠球囊損傷后可見動脈內(nèi)皮剝脫，部分內(nèi)彈力板由正常的波浪狀變平坦，失去彈性；并且新生內(nèi)膜形成并增厚，新生內(nèi)膜中可見大量血管平滑肌細胞，纖維成分增多，管腔呈向心或偏心性狹窄，中膜可見血管平滑肌細胞排列紊亂。假手術組、模型組和高、低劑量蛇床子素組的I/M比值分別為（0.14±0.03）、（0.87±0.13）、（0.45±0.14）和（0.56±0.16），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=25.768，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與假手術組比較，模型組I/M比值升高（t=5.864，P=0.000）；低劑量和高劑量蛇床子素組的I/M比值與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.004和3.281，P=0.032和0.027），低劑量和高劑量蛇床子素組血管壁厚度減小，抑制了新生內(nèi)膜的形成。見圖1。

2.2 新生血管內(nèi)膜中PCNA的表達

PCNA染色陽性細胞呈紅色熒光。假手術組、模型組和高、低劑量蛇床子素組的PCNA表達指數(shù)分別為（20.1±1.2）%、（54.8±4.9）%、（28.3±3.9）%和（41.2±4.1）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=17.476，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.104，P=0.000），模型組新生平滑基層可見大量的陽性表達細胞；低劑量和高劑量蛇床子素組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.564和4.132，P=0.034和0.028），低劑量和高劑量蛇床子素組的新生平滑基層PCNA陽性細胞數(shù)較少。見圖2。

圖1 各組大鼠頸動脈 （HE）

圖2 各組新生血管內(nèi)膜中PCNA的表達 （×400）

2.3 受損血管TNF-α和IL-1β水平

各組TNF-α和IL-1β水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型成立。模型組較假手術組大鼠血管TNF-α和IL-1β水平升高（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，低劑量蛇床子素組TNF-α和IL-1β水平低于模型組（P＜0.05）；高劑量蛇床子素組TNF-α和IL-1β水平低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組受損血管TNF-α和IL-1β水平比較（pg/ml，±s）

表1 各組受損血管TNF-α和IL-1β水平比較（pg/ml，±s）

注：1）與假手術組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 TNF-α IL-1β假手術組（n =8） 38.7±4.2 22.5±2.5模型組（n =7） 103.8±5.21） 59.1±4.31）低劑量蛇床子素組（n =7） 83.5±8.12） 41.9±5.22）高劑量蛇床子素組（n =8） 56.2±5.32） 34.3±5.52）F值 74.080 34.424 P值 0.000 0.000

2.4 各組血管NF-κB和TLR4蛋白表達的變化

各組NF-κB和TLR4蛋白表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組NF-κB蛋白表達水平較假手術組升高（P＜0.05）；不同劑量蛇床子素給藥干預后，較模型組NF-κB蛋白表達水平降低（P＜0.05）。模型組TLR4蛋白表達水平較假手術組升高（P＜0.05）；而給予高、低劑量蛇床子素后，可抑制TLR4蛋白過表達（P＜0.05）。見表2和圖3。

表2 各組血管NF-κB 和TLR4蛋白表達水平比較 （±s）

表2 各組血管NF-κB 和TLR4蛋白表達水平比較 （±s）

注：1）與假手術組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 NF-κB TLR4假手術組（n =8） 0.156±0.017 0.214±0.065模型組（n =7） 0.643±0.0181） 0.582±0.0601）低劑量蛇床子素組（n =7） 0.359±0.0202） 0.317 ± 0.0412）高劑量蛇床子素組（n =8） 0.282±0.0422） 0.257 ± 0.0432）F值 184.069 28.827 P值 0.000 0.000

圖3 各組血管NF-κB和TLR4蛋白的表達

3 討論

預防術后再狹窄是當前心血管病學研究領域所面臨的重要課題之一。研究表明，球囊擴張對血管壁的直接損傷導致多種炎癥應答、細胞生長因子的釋放和血管平滑肌細胞的增殖、遷移、表型改變，以及血管內(nèi)膜增生，共同造成術后再狹窄的發(fā)生[11-12]。本實驗采用不同劑量蛇床子素治療頸動脈球囊損傷大鼠。HE染色結果表明，模型組I/M比值高于假手術組，蛇床子素給藥干預后，與模型組比較I/M比值降低，表明蛇床子素具有抑制內(nèi)膜增生的作用。

PCNA只存在于正常增殖細胞和腫瘤細胞，參與細胞DNA的合成，反映細胞增殖狀態(tài)。因此，通過其表達的高低可以間接反映血管平滑肌細胞的增殖情況。實驗結果顯示，模型組大鼠新生內(nèi)膜中PCNA陽性表達指數(shù)最高，在蛇床子素組，新生內(nèi)膜中PCNA陽性表達指數(shù)較模型組降低，說明蛇床子素通過抑制血管平滑肌細胞的增殖，從而降低新生內(nèi)膜的增生。

TLR可以調(diào)控獲得性免疫應答類，TLR4介導的炎癥細胞發(fā)揮重要作用，其與增殖的血管平滑肌細胞參與動脈粥樣硬化形成和再狹窄[13]。激活狀態(tài)的TLR4可活化NF-κB，產(chǎn)生趨化因子和細胞因子，如IL-1β、TNFα[14-15]。NF-κB激活介導炎癥級聯(lián)反應，血栓形成，刺激炎癥基因持續(xù)表達，促進TNF-α、IL-lβ的分泌，導致新生內(nèi)膜形成，促使其增殖、遷移，最終導致血管壁發(fā)生病理改變。因此，有效控制炎癥反應是控制術后再狹窄發(fā)生、發(fā)展的有效途徑之一[16]。抑制TLR4/NF-κB激活便可有效阻止其介導的下游炎癥反應，阻斷其調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖。本研究結果發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可以降低球囊損傷大鼠動脈血管TLR4/NF-κB的表達和炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-lβ水平，進而延緩或減輕移植靜脈再狹窄的病變程度。

總之，蛇床子素通過抑制TLR4/NF-κB的表達，減少炎癥因子TNF-α和IL-1β的生成，抑制大鼠頸動脈球囊損傷后誘導的內(nèi)膜增生、血管平滑肌細胞增殖。本研究為臨床應用蛇床子素，預防術后再狹窄的發(fā)生提供了實驗依據(jù)。