劉攀道，郇恒福，劉一明，劉國(guó)道，白昌軍，陳志堅(jiān)

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

磷(phosphorus, P)是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，在植物新陳代謝過程中發(fā)揮著重要作用[1]。土壤中的磷主要以無機(jī)難溶性磷(鐵磷、鋁磷和鈣磷等)和有機(jī)磷的形式存在，不能直接被植物吸收利用[2]。無機(jī)可溶性磷(Pi)是植物可以從土壤中直接吸收的主要磷形式，但Pi在土壤中的濃度較低，難以滿足植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的需要[3]。全球近70%的耕地中存在磷有效性低的問題，特別在酸性土壤中，低磷脅迫已成為限制這些地區(qū)農(nóng)作物和牧草生產(chǎn)的主要障礙因子之一[4-5]。

在植物適應(yīng)環(huán)境的長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，形成了一系列適應(yīng)性機(jī)制來應(yīng)對(duì)低磷脅迫，如通過調(diào)控根系形態(tài)構(gòu)型的改變，從而擴(kuò)增根系與土壤的接觸面積[6]；與AM真菌形成共生菌根來增強(qiáng)植物從根際土壤中獲取磷素的能力[7]；根系分泌有機(jī)酸和磷酸酶來促進(jìn)對(duì)難溶性磷和有機(jī)磷的活化利用[8]；誘導(dǎo)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)來提高根系對(duì)土壤中磷素的吸收能力[9]等。酸性磷酸酶(acid phosphatase, APase, ACP)是一類能催化磷酸單酯或酸酐裂解從而釋放無機(jī)磷酸根離子，且最適pH低于7.0的水解酶類[10]，ACP活性的增加被認(rèn)為是植物適應(yīng)低磷環(huán)境的普遍響應(yīng)[11]。對(duì)擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)和菜豆(Phaseolusvulgaris)等多種植物的研究表明，在低磷脅迫下，這些植物體內(nèi)的ACP活性均顯著增加，從而促進(jìn)植物對(duì)有機(jī)磷的活化利用[12-13]。

柱花草(Stylosanthesspp.)原產(chǎn)于美洲和非洲的熱帶與亞熱帶地區(qū)。我國(guó)從20世紀(jì)60年代開始引種柱花草，目前，柱花草已成為我國(guó)南方地區(qū)重要的熱帶豆科牧草之一[14-15]。柱花草對(duì)酸性低磷土壤的適應(yīng)性強(qiáng)，能高效活化利用外源有機(jī)磷[16]。最近，通過分子生物學(xué)研究手段鑒定到3個(gè)柱花草ACP，即SgPAP7、SgPAP10和SgPAP26，這些ACP參與了柱花草對(duì)外源核苷酸類有機(jī)磷(dNTP)的活化利用[17]。但是，關(guān)于柱花草ACP參與其體內(nèi)磷活化利用的生理機(jī)制仍不清楚。本研究以前期研究中獲得的太空誘變耐低磷柱花草突變體TPRC2001-84及其親本熱研2號(hào)(RY2)為材料[18]，通過分析它們?cè)诘土酌{迫下的生物量、磷效率、細(xì)胞壁磷含量和ACP活性的差異，解析TPRC2001-84耐低磷的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)條件

本課題組前期利用返地衛(wèi)星對(duì)柱花草RY2的種子進(jìn)行空間輻射誘變處理，通過對(duì)誘變后代進(jìn)行連續(xù)5年選育，獲得了85個(gè)穩(wěn)定品系[14]，其中TPRC2001-84在酸性缺磷土壤的田間試驗(yàn)條件下(土壤速效磷含量0.3～1.8 mg·kg-1，試驗(yàn)期間不施磷肥)，其干草產(chǎn)量顯著高于親本RY2，具有優(yōu)良的耐低磷特性[18]。本研究以TPRC2001-84和RY2柱花草為試驗(yàn)材料，于2016年8-9月在海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧草基地網(wǎng)室內(nèi)，通過營(yíng)養(yǎng)液水培方法，對(duì)柱花草進(jìn)行低磷脅迫處理[16,19-20]。柱花草種子萌發(fā)后，先在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)2周，隨后進(jìn)行正常供磷(+P，250 μmol·L-1KH2PO4)和低磷(-P，5 μmol·L-1KH2PO4)兩個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)。處理20 d后收獲樣品，在75 ℃烘干到恒重后測(cè)定植株干重和全磷含量，并計(jì)算磷利用效率。同時(shí)收取從頂端開始完全展開的第3～6片功能葉和根系材料，用液氮速凍，用于測(cè)定可溶性磷濃度、細(xì)胞壁磷含量和ACP活性。

1.2 全磷含量、可溶性磷濃度的測(cè)定及磷吸收效率和磷利用效率的表示方法

全磷含量和可溶性磷濃度的測(cè)定參照Murphy等[21]的方法，取適量體積的樣品磷提取液(不超過0.2 mL)，用超純水定容到4.5 mL，再加入0.5 mL鉬銻抗顯色液，混勻后靜置30 min，測(cè)OD700的吸光度值。磷吸收效率用每株柱花草的全磷含量(mg P)表示，磷利用效率用單位磷素(mg P)所產(chǎn)生的干物質(zhì)量(g DW)表示[22]。

1.3 細(xì)胞壁的分離和細(xì)胞壁磷含量的測(cè)定

細(xì)胞壁的分離參照Zhu等[23]的方法，柱花草葉片和根系鮮樣用液氮研磨成粉末后，加入75%乙醇研磨成勻漿，冰浴20 min，8000 r·min-1離心10 min后保留沉淀。沉淀依次用丙酮、乙醇/三氯甲烷混合液(v/v=1/1)、甲醇洗滌。洗滌方法為加入相應(yīng)液體后研磨成勻漿并冰浴20 min，隨后8000 r·min-1離心10 min，最終獲得的沉淀即為細(xì)胞壁提取物。稱取5 mg分離后的細(xì)胞壁放入離心管中，加入1 mL鹽酸(2 mmol·L-1)提取細(xì)胞壁中的磷。離心管置于搖床上振蕩48 h。隨后離心(14000 r·min-1，4 ℃，30 min)分離上清液，參照Ohno等[24]的方法以孔雀石綠為顯色劑測(cè)定細(xì)胞壁中的磷。用單位鮮重細(xì)胞壁(mg CW)所含的磷(μg P)表示細(xì)胞壁磷含量。

1.4 細(xì)胞壁蛋白的提取與ACP活性的測(cè)定

細(xì)胞壁蛋白的提取參照Robinson等[25]的方法，液氮速凍的柱花草鮮樣用TES/KOH緩沖液(25 mmol·L-1，pH 7.4，含10 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1二硫蘇糖醇，1%(v/v)Triton X-100，1%(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮)充分研磨后離心(14000 r·min-1，4 ℃，30 min)收集沉淀。按上述步驟用TES/KOH緩沖液再洗滌沉淀3次。收集的沉淀用醋酸/NaOH緩沖液(0.5 mmol·L-1，pH 4.6，含0.2 mol·L-1CaCl2)研磨后離心(18000 r·min-1，4 ℃，30 min)，收集上清液即為細(xì)胞壁蛋白提取液。參照Bradford[26]的方法測(cè)定蛋白濃度。ACP活性參照Liu等[17]的方法，取1.8 mL磷酸酶底物緩沖液[含1 mmol·L-1對(duì)硝基苯磷酸環(huán)己胺(ρ-NPP)，用45 mmol·L-1的醋酸-醋酸鈉buffer(pH=5.0)配制]，加入適量體積的蛋白提取液，并用超純水補(bǔ)足2 mL。混勻后于37 ℃反應(yīng)15 min，用1 mL NaOH溶液(1 mol·L-1)終止反應(yīng)，混勻后12000 r·min-1離心2 min，吸取上清液測(cè)OD405的吸光度值。磷酸酶活性用單位時(shí)間內(nèi)(min)單位蛋白(mg)水解ρ-NPP的量(μmol)表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖

通過SPSS 18.0(IBM-SPSS，美國(guó))對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Origin 8.0(OriginLab，美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫對(duì)柱花草生物量、磷吸收效率和磷利用效率的影響

由圖1可知，柱花草的干重、磷吸收效率和磷利用效率受低磷脅迫的顯著影響。低磷處理顯著降低TPRC2001-84與RY2的植株干重和磷吸收效率(P<0.05)，但顯著增加了磷利用效率(P<0.05)(圖1)。相對(duì)于正常供磷處理(+P)，低磷處理(-P)使TPRC2001-84和RY2植株干重分別降低26.9%和51.9%(圖1A)，磷吸收效率分別降低91.5%和92.5%(圖1B)。但是，TPRC2001-84和RY2在低磷處理下的磷利用效率分別比正常供磷處理增加7.7和5.4倍(圖1C)。

在正常供磷條件下，兩份柱花草材料的植株干重、磷吸收效率和磷利用效率均無顯著差異(圖1)。然而，在低磷處理下，TPRC2001-84的植株干重和磷利用效率顯著高于RY2(P<0.05)，分別是RY2的1.6和1.4倍(圖1A和C)。以上結(jié)果說明，相對(duì)RY2，柱花草TPRC2001-84具有較強(qiáng)的耐低磷能力和較高的磷利用效率。

2.2 低磷脅迫對(duì)柱花草葉片和根系可溶性磷濃度及細(xì)胞壁磷含量的影響

圖2的結(jié)果表明，低磷處理顯著降低了柱花草TPRC2001-84與RY2葉片和根系的可溶性磷濃度(P<0.05)。在低磷處理下(-P)，柱花草TPRC2001-84與RY2葉片可溶性磷濃度分別只有正常供磷條件下(+P)的22.2%和18.4%，而根系可溶性磷濃度分別只有正常供磷條件下的16.1%和12.6%(圖2)。此外，雖然兩份柱花草材料葉片和根系的可溶性磷濃度在正常供磷條件下無顯著差異，但是，在低磷處理下，TPRC2001-84葉片和根系的可溶性磷濃度分別比RY2高36.8%和42.6%，差異顯著(P<0.05)(圖2)。

圖1 不同供磷條件下柱花草的植株干重、磷吸收效率和磷利用效率Fig.1 Plant dry weight, P acquisition efficiency and P utilization efficiency in stylo at different P levels 不同的大寫字母表示TPRC2001-84在+P與-P處理之間差異顯著(P<0.05)，不同的小寫字母表示RY2在+P與-P處理之間差異顯著(P<0.05)。*表示在相同磷處理下TPRC2001-84與RY2之間差異顯著(P<0.05)，n.s.表示TPRC2001-84與RY2之間差異不顯著。下同。Different capital letters indicate significant difference of TPRC2001-84 between +P and -P treatment at P<0.05 level. Different lowercase letters indicate significant difference of RY2 between +P and -P treatment at P<0.05 level. * Indicate significant difference and n.s. indicate no significant difference between TPRC2001-84 and RY2 in the same phosphorus treatment at P<0.05 level. The same below.

圖2 不同供磷條件下柱花草葉片和根系的可溶性磷濃度Fig.2 Soluble Pi concentration in the leaves and roots of stylo at different P levels

從圖3可以看出，兩份柱花草材料的葉片和根系細(xì)胞壁磷含量在低磷處理下顯著降低(P<0.05)，在低磷處理下，TPRC2001-84與RY2葉片細(xì)胞壁磷含量分別只有正常供磷條件下的6.9%和10.6%，而根系細(xì)胞壁磷含量分別只有正常供磷條件下的10.2%和14.8%(圖3)。在正常供磷處理下，TPRC2001-84與RY2的葉片和根系細(xì)胞壁磷含量差異不明顯，但在低磷處理下，TPRC2001-84葉片和根系的細(xì)胞壁磷含量分別只有RY2的71.6%和72.7%。以上結(jié)果表明，在低磷條件下，TPRC2001-84細(xì)胞壁中有更多的磷被活化釋放出來。

2.3 低磷脅迫對(duì)柱花草總ACP及細(xì)胞壁ACP活性的影響

由圖4可知，相對(duì)正常供磷處理(+P)，低磷處理(-P)顯著提高了TPRC2001-84與RY2葉片和根系總ACP活性(P<0.05)。在低磷處理下，TPRC2001-84和RY2葉片總ACP活性分別是正常供磷條件下的1.72和1.71倍，根系總ACP活性分別是正常供磷條件下的3.4和2.8倍，差異顯著(P<0.05)。然而，在相同磷處理?xiàng)l件下，兩份柱花草材料的葉片和根系總ACP活性差異不明顯。

低磷處理顯著提高了TPRC2001-84與RY2葉片和根系的細(xì)胞壁ACP活性(P<0.05)(圖5)。在低磷處理下，TPRC2001-84和RY2葉片細(xì)胞壁ACP活性分別是正常供磷條件下的2.4和1.8倍，根系細(xì)胞壁ACP活性分別是正常供磷條件下的3.9和2.7倍(圖5)。兩份柱花草材料在正常供磷條件下的葉片和根系的細(xì)胞壁ACP活性差異不顯著，然而，在低磷處理下，TPRC2001-84葉片和根系的細(xì)胞壁ACP活性分別比RY2高46.6%和53.6%，差異顯著(P<0.05)(圖5)。以上結(jié)果表明，相對(duì)RY2，TPRC2001-84在低磷脅迫下具有較高的細(xì)胞壁ACP活性。

圖3 不同供磷條件下的柱花草葉片和根系細(xì)胞壁磷含量Fig.3 Cell wall P content in the leaves and roots of stylo at different P levels

圖4 柱花草葉片和根系在不同磷水平下的總酸性磷酸酶活性Fig.4 Total APase activity in the leaves and roots of stylo at different P levels

圖5 柱花草葉片和根系在不同磷水平下的細(xì)胞壁酸性磷酸酶活性Fig.5 Cell wall APase activity in the leaves and roots of stylo at different P levels

3 討論

低磷脅迫導(dǎo)致全球范圍內(nèi)農(nóng)作物產(chǎn)量下降30%～40%[2]。由于磷肥的當(dāng)季利用率低(通常只有10%～20%)，施用磷肥只能部分解決作物對(duì)磷素的需求，并且，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，投入的磷肥因其不能被及時(shí)吸收利用而流失，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化和環(huán)境污染[27]。因此，為保持農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，最為行之有效的方式就是優(yōu)化養(yǎng)分管理，并結(jié)合育種技術(shù)改良作物的磷營(yíng)養(yǎng)性狀，綜合提高作物的磷效率(包括磷吸收效率和磷利用效率)[28]。

通過太空誘變育種，我國(guó)已獲得了水稻、小麥、棉花(Gossypiumhirsutum)、辣椒(Capsicumannuum)、番茄(Lycopersiconesculentum)和芝麻(Sesamumindicum)等多種作物和蔬菜的誘變新品種[29]。本課題組前期的研究中也利用太空誘變技術(shù)獲得了一份耐低磷的柱花草突變體TPRC2001-84[14,18]。本研究的結(jié)果表明，TPRC2001-84在低磷處理下的植株干重顯著高于親本RY2(圖1A)，說明在低磷脅迫下TPRC2001-84具有較高的磷效率。TPRC2001-84與RY2的磷吸收效率無顯著差異(圖1B)，但TPRC2001-84在低磷處理下的磷利用效率顯著高于RY2(圖1C)，表明在低磷脅迫下TPRC2001-84較高的磷效率主要是由其較高的磷利用效率所決定。

為適應(yīng)低磷脅迫環(huán)境，植物形成了一系列適應(yīng)性機(jī)制來最大效率地提高磷的吸收和利用，以維持植物體內(nèi)磷的平衡[8]。其中，低磷脅迫下增加ACP活性是糧食作物(水稻、大麥、小麥、玉米等)，油料作物[大豆、油菜(Brassicanapus)等]，蔬菜(菜豆、番茄等)和牧草[苜蓿(Medicagotruncatula)、白羽扇豆(Lupinusalbus)、白三葉(Trifoliumrepens)等]中均存在的應(yīng)答反應(yīng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，低磷處理顯著提高了柱花草TPRC2001-84和RY2的ACP活性(圖4和5)，表明誘導(dǎo)ACP活性增加是植物廣泛存在的一種適應(yīng)低磷脅迫機(jī)制。

細(xì)胞壁是植物貯存磷的場(chǎng)所之一。在低磷脅迫環(huán)境下，植物衰老組織中細(xì)胞壁儲(chǔ)藏的磷可被活化和再利用，滿足新陳代謝旺盛部位對(duì)磷素的需求，而定位于細(xì)胞壁的酸性磷酸酶在這個(gè)過程中可能發(fā)揮著重要作用[25]。在擬南芥中已鑒定多個(gè)細(xì)胞壁定位的ACP，包括紫色酸性磷酸酶AtPAP12、AtPAP26和核糖核酸酶AtRNS2。對(duì)這3個(gè)ACP的生物學(xué)功能分析表明，它們參與了DNA(脫氧核糖核酸)或ADP(腺苷二磷酸)的活化利用[25,30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低磷處理下，磷利用效率高的TPRC2001-84葉片和根系可溶性磷濃度顯著高于RY2(圖2)，但TPRC2001-84葉片和根系中的細(xì)胞壁磷含量低于RY2(圖3)，說明當(dāng)體內(nèi)磷缺乏時(shí)，TPRC2001-84可能通過活化釋放細(xì)胞壁中貯存的磷，從而提高細(xì)胞內(nèi)的可溶性磷濃度。類似的，在低磷脅迫下，相對(duì)于磷低效水稻品種，磷高效水稻品種具有較高的細(xì)胞內(nèi)可溶性磷濃度和較低的細(xì)胞壁磷含量[23]。此外，在低磷處理下，雖然TPRC2001-84與RY2葉片和根系總ACP活性無顯著差異，但是，細(xì)胞壁磷含量低的TPRC2001-84具有較高的葉片和根系細(xì)胞壁ACP活性，而細(xì)胞壁磷含量高的RY2，細(xì)胞壁ACP活性顯著低于TPRC2001-84(圖4和5)，進(jìn)一步說明了柱花草細(xì)胞壁磷含量受到細(xì)胞壁ACP活性的影響。

4 結(jié)論

本研究從生理水平上初步解析了柱花草TPRC2001-84在低磷脅迫下具有較高的磷利用效率和較低的細(xì)胞壁磷含量的機(jī)理，其主要通過調(diào)控細(xì)胞壁ACP活性來實(shí)現(xiàn)。研究結(jié)果可為培育適應(yīng)我國(guó)南方酸性缺磷土壤的柱花草新品種提供種質(zhì)資源和理論依據(jù)。