孫大明，李弘偉，毛勝勇，劉軍花

(江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，江蘇 南京 210095)

瘤胃是反芻動(dòng)物重要的消化器官，新生羔羊瘤胃內(nèi)壁光滑、顏色淺，隨日齡的增加和固體飼料的采食，瘤胃壁逐漸增厚、乳頭增長(zhǎng)、瘤胃發(fā)酵功能逐漸建立[1]。同時(shí)，幼齡時(shí)期是動(dòng)物胃腸道迅速發(fā)育的時(shí)期，其發(fā)育狀況對(duì)成年后的機(jī)體健康及生產(chǎn)性能具有重要影響[2]。所以在反芻動(dòng)物幼齡期調(diào)節(jié)瘤胃的發(fā)育顯得尤為重要。研究表明盡早補(bǔ)飼開食料可以促進(jìn)羔羊瘤胃發(fā)育，在實(shí)際生產(chǎn)中，犢牛和羔羊一般在出生后的7～10 d開始補(bǔ)飼高淀粉含量的開食料以促進(jìn)羔羊瘤胃的發(fā)育。

淀粉是開食料中的重要成分，而淀粉在瘤胃中的降解受諸多條件的影響，如直鏈淀粉比例，淀粉結(jié)晶度和淀粉顆粒結(jié)構(gòu)等[3]。Stevnebo等[4]通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)淀粉中支鏈淀粉比例與淀粉的降解率呈顯著正相關(guān)。Ren 等[5]也發(fā)現(xiàn)高支鏈淀粉比例的淀粉在瘤胃中降解率比較高。研究表明，不同來(lái)源淀粉中直/支鏈淀粉比不同，在瘤胃中的降解率也不同，如木薯(Manihotesculenta)、水稻(Oryzasativa)和小麥(Triticumaestivum)支鏈淀粉含量較高，在瘤胃中的發(fā)酵率較高；豆類淀粉，尤其是豌豆(Pisumsativum)支鏈淀粉含量較低，在瘤胃內(nèi)的降解率較低[6-7]。Lesmeister等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與飼喂含有細(xì)磨玉米的開食料相比，犢牛飼喂含有易發(fā)酵蒸汽壓片玉米的開食料更能有效地促進(jìn)瘤胃上皮的發(fā)育。所以推測(cè)羔羊飼喂不同直/支鏈淀粉開食料會(huì)影響羔羊瘤胃上皮的發(fā)育。本研究的主要目的將從形態(tài)及分子水平研究不同直/支鏈淀粉開食料對(duì)羔羊瘤胃上皮發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物飼養(yǎng)

試驗(yàn)于2015年10-12月在江蘇省蘇州市湖羊種羊場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)選取24只體況良好、胎次一致、體重相近的初生羔羊(湖羊)，將其隨機(jī)分為木薯淀粉組(cassava starch，CS，n=8)、玉米(Zeamays)淀粉組(maize starch，MS，n=8)和豌豆淀粉組(pea starch，PS，n=8)(直/支鏈淀粉比分別約為0.11，0.27和0.44)。從10日齡開始，每天4:00-19:00將羔羊抱入補(bǔ)飼欄與母羊分離，各組羔羊自由采食不同直/支鏈淀粉比的開食料。其間在6:30, 10:30和15:30將羔羊抱回母羊舍哺乳1 h。試驗(yàn)期間，羔羊自由飲水，單欄飼喂，自由采食燕麥干草，每周監(jiān)測(cè)羔羊體重變化及臨床參數(shù)變化。當(dāng)羔羊每天可以采食200 g干物質(zhì)開食料時(shí)不再繼續(xù)增加開食料的量，并且所有羔羊在屠宰前7 d時(shí)均能每天采食200 g干物質(zhì)開食料。不同直/支鏈淀粉比開食料配方依據(jù)湖羊開食料營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)(NY/Y816-2004; 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部, 2004)設(shè)計(jì)(表1)。

1.2 樣品采集

羔羊56 日齡時(shí)，晨飼2 h后屠宰采樣，采集三部分腹囊部的瘤胃組織塊，并在冰的磷酸緩沖鹽溶液里清洗3次，一部分用鈍物將漿膜層和肌肉層分離得到瘤胃上皮，剪成約0.5 cm×0.5 cm的小碎塊置于液氮保存，用于RNA的提取；一部分修剪成1.0 cm×1.0 cm的組織塊置于4%多聚甲醛(Sigma，美國(guó))溶液中用于組織形態(tài)學(xué)分析；一部分修剪成1.0 cm×1.0 cm的組織塊置于冰上用于瘤胃乳頭長(zhǎng)度、寬度和個(gè)數(shù)的測(cè)定。

1.3 淀粉含量測(cè)定

開食料中總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量采用總淀粉試劑盒和直/支鏈淀粉試劑盒測(cè)定(Megazyme，愛(ài)爾蘭)。

1.4 瘤胃上皮形態(tài)學(xué)測(cè)定

放在冰上的瘤胃組織塊(1.0 cm×1.0 cm)當(dāng)天用于測(cè)定瘤胃乳頭個(gè)數(shù)，然后每個(gè)樣品隨機(jī)選擇15個(gè)瘤胃乳頭用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(三豐，日本)測(cè)量每個(gè)瘤胃乳頭的長(zhǎng)度和寬度。將固定在4%多聚甲醛的瘤胃組織做石蠟切片，蘇木精和伊紅染色，切片厚度為6 μm，用于瘤胃乳頭上皮各層厚度的測(cè)量。在進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析時(shí)采用盲檢的方法，在40×物鏡下選擇每個(gè)樣本的5個(gè)完整瘤胃乳頭進(jìn)行測(cè)量。運(yùn)用Image Pro Plus軟件進(jìn)行測(cè)量，瘤胃上皮各層厚度的測(cè)量參照Steelo等[9]的方法。角質(zhì)層定義為最外面的染色較重含有細(xì)胞質(zhì)殘留物但沒(méi)有細(xì)胞核的細(xì)胞層；顆粒層為長(zhǎng)軸型細(xì)胞，染色較淺并與棘狀層和基底層垂直；棘狀層和基底層沒(méi)有明顯的分界線將其定義為位于顆粒層和固有層之間的細(xì)胞層。

1.5 RNA的提取和cDNA的合成

瘤胃上皮總RNA的提取參照Chomczynski等[10]的方法。使用微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo，美國(guó))測(cè)定RNA的濃度和純度。所有樣品的吸收比例都為1.96～2.08， 證明RNA純度較高。 用1.4%的瓊脂糖膠檢測(cè)RNA的完整性。將所有的RNA濃度調(diào)整到0.5 μg·μL-1置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠煤蚪MRNA酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara生物，日本)進(jìn)行cDNA的合成。

表1 開食料飼料成分和營(yíng)養(yǎng)水平表 (干物質(zhì)基礎(chǔ)) Table 1 Ingredient and nutrient composition of the starter diet (dry matter basis)

注：1預(yù)混料每kg飼糧提供：Zn 102 g，Mn 47 g，Cu 26 g，I 1140 mg，Se 500 mg，Co 340 mg，維生素A 17167380 IU，維生素D 858370 IU，維生素E 23605 IU；2該數(shù)值是基于NRC (2007)數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算值；3該數(shù)值是實(shí)際測(cè)量值。

Note：1Contained 102 g·kg-1of Zn, 47 g·kg-1of Mn, 26 g·kg-1of Cu, 1140 mg·kg-1of I, 500 mg·kg-1of Se, 340 mg·kg-1of Co, 17167380 IU·kg-1of vitamin A, 858370 IU·kg-1of vitamin D, and 23605 IU·kg-1of vitamin E;2Values were analyzed based on database of the NRC (2007);3The actual values for measurement.

1.6 引物的合成和實(shí)時(shí)定量PCR

利用Q5 Real-time PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))對(duì)細(xì)胞周期蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor，IGF-1)及內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行定量，GAPDH引物序列參照Wang等[11]的方法，實(shí)時(shí)定量PCR分析所用引物采用Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。SYBR購(gòu)自Takara公司，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體積20 μL：10.4 μL SYBR，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，2 μL樣品cDNA以及6.8 μL無(wú)菌水。所有樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。目的基因的相對(duì)表達(dá)量以管家基因GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行校正，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT的方法。

表2 qRT-PCR基因引物序列Table 2 Primers for quantitative real time PCR

1.7 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SEM)進(jìn)行表示。采用SPSS 20.0中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性分析，采用Turkey法進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生產(chǎn)性能及臨床癥狀觀察

所有羔羊在試驗(yàn)期內(nèi)未發(fā)生明顯的臨床癥狀。CS、MS和PS組羔羊的初生重[(3.31±0.11),(3.48±0.13),(3.35±0.12) kg，P=0.594]無(wú)顯著性差異，56日齡體增重[(11.56±0.69),(11.13±0.31),(10.29±0.40) kg，P=0.204]也無(wú)顯著差異。

2.2 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃乳頭形態(tài)的影響

3種不同直/支鏈淀粉比開食料顯著影響了羔羊瘤胃乳頭形態(tài)(表3)。CS組羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度和吸收表面積顯著(P<0.001)高于MS和PS組，CS和MS組羔羊瘤胃乳頭寬度顯著(P=0.001)高于PS組，3組羔羊瘤胃乳頭密度無(wú)顯著差異(P=0.114)。對(duì)瘤胃上皮各層厚度統(tǒng)計(jì)顯示，CS和PS組羔羊瘤胃上皮角質(zhì)層厚度顯著(P=0.001)高于MS組；CS和MS組羔羊瘤胃上皮顆粒層厚度顯著(P<0.001)高于PS組；CS組羔羊瘤胃上皮棘基層厚度和總厚度顯著(P<0.001)高于MS和PS組。

2.3 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞周期蛋白mRNA表達(dá)量的影響

CS組羔羊瘤胃上皮細(xì)胞cyclinA(P=0.013)和CDK4(P=0.016)的mRNA表達(dá)量顯著高于PS組(圖1)，但和MS組無(wú)顯著差異；CS組羔羊瘤胃上皮細(xì)胞CDK2和CDK6的mRNA表達(dá)量顯著高于MS和PS組(CS>MS>PS，P<0.001)； CS組羔羊瘤胃上皮cyclinD1的mRNA表達(dá)量顯著(P=0.012)低于PS組，但和MS組無(wú)顯著差異；3組羔羊瘤胃上皮cyclinE的mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異(P=0.353)。

表3 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃上皮形態(tài)和各層厚度的影響Table 3 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on papillae morphology and the thickness of different stratum of rumen epithelium in pre-weaned lambs

圖1 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞周期蛋白mRNA表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on cell cycle protein mRNA expression of rumen epithelium in pre-weaned lambs 不同字母表示平均值有顯著差異(P<0.05)。下同。Different letters are significantly different (P<0.05). The same below.

圖2 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃上皮IGF-1和IGF-1R的mRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on the IGF-1 and IGF-1R mRNA expression of rumen epithelium in pre-weaned lambs

2.4 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃上皮IGF-1和IGF-1R的mRNA表達(dá)量的影響

CS組羔羊瘤胃上皮IGF-1的mRNA表達(dá)量顯著(P<0.001)高于MS和PS組(圖2)，CS和MS組羔羊瘤胃上皮IGF-1R的mRNA表達(dá)量顯著(P=0.001)高于PS組。

3 討論

3.1 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃乳頭形態(tài)的影響

瘤胃是反芻動(dòng)物重要的消化器官，羔羊時(shí)期瘤胃的發(fā)育狀況對(duì)成年后的機(jī)體健康及生產(chǎn)性能具有重要影響[12]。Khan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與含有較高直鏈淀粉的燕麥(Avenasativa)和大麥相比，含有較低直鏈淀粉的小麥和玉米淀粉開食料更能促進(jìn)犢牛瘤胃乳頭的發(fā)育，主要包括增加瘤胃乳頭的長(zhǎng)度和寬度。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)，含有較低直鏈淀粉的木薯淀粉開食料組增加了羔羊瘤胃乳頭的長(zhǎng)度、寬度和表面積。同時(shí)，切片結(jié)果顯示，木薯淀粉開食料顯著增加了羔羊瘤胃上皮角質(zhì)層、顆粒層、棘基層和總上皮的厚度。以上結(jié)果表明，木薯淀粉開食料更好地刺激了羔羊瘤胃乳頭的發(fā)育。

3.2 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞周期蛋白mRNA表達(dá)量的影響

以上研究結(jié)果表明,飼喂含有較高支鏈淀粉的木薯淀粉開食料顯著促進(jìn)了羔羊瘤胃上皮的發(fā)育。為了研究木薯淀粉開食料促進(jìn)瘤胃上皮發(fā)育的機(jī)制，對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞周期蛋白和相關(guān)依賴性激酶的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，主要包括靜止期(G0期)、分裂間期(G1、S和G2期)和有絲分裂期(M期)。細(xì)胞周期的推進(jìn)主要受細(xì)胞周期蛋白(cyclins)及其相關(guān)激酶(cyclin dependent protein kinases, CDKs)的調(diào)控。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)木薯淀粉開食料顯著促進(jìn)了瘤胃上皮cyclinE，CDK2，CDK4和CDK6的mRNA表達(dá)。研究表明，cyclinD1和cyclinE表達(dá)升高均能導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期進(jìn)程加快[14]。Filmus等[14]研究發(fā)現(xiàn)cyclinD1或cyclinD1-CDK4/CDK6復(fù)合物的表達(dá)升高有利于縮短大鼠小腸上皮細(xì)胞G1期的持續(xù)時(shí)間，推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。Norbury等[15]也研究發(fā)現(xiàn)cyclinE通過(guò)與CDK2結(jié)合成復(fù)合體促進(jìn)處于G1期的細(xì)胞向 S 期移行，cyclinE的表達(dá)越高其作用也越大。但是，本研究發(fā)現(xiàn)木薯淀粉組羔羊瘤胃上皮cyclinD1的mRNA表達(dá)量顯著較低，這與瘤胃上皮形態(tài)結(jié)果不相符，所以需要我們進(jìn)一步在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，木薯淀粉開食料組羔羊瘤胃上皮cyclinA的mRNA表達(dá)量較高。研究表明，cyclinA在S階段和G2/M階段發(fā)揮重要作用[16]，cyclinA-CDK2復(fù)合物使關(guān)鍵DNA復(fù)制因子磷酸化驅(qū)動(dòng)染色體的復(fù)制[17]。Girard等[18]也提出，cyclinA在控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA復(fù)制中起主要作用。以上研究結(jié)果顯示，木薯淀粉通過(guò)促進(jìn)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞周期蛋白和相關(guān)依賴性激酶的表達(dá)，推動(dòng)了細(xì)胞周期循環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)了羔羊瘤胃上皮發(fā)育。

3.3 斷奶前補(bǔ)飼不同直/支鏈淀粉比開食料對(duì)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞IGF-1和IGF-1R的mRNA表達(dá)量的影響

研究表明，細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)受較多因素的影響，例如：IGF-1，上皮調(diào)節(jié)因子等。IGF-1作為有絲分裂原刺激劑，在和受體結(jié)合后可以激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖以及機(jī)體、器官、組織的生長(zhǎng)發(fā)育。Lu等[19]體外研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞cyclins的表達(dá)。Shen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，山羊飼喂高能量飼料可以刺激瘤胃上皮IGF-1的表達(dá)，進(jìn)而刺激瘤胃上皮的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，木薯淀粉開食料組羔羊瘤胃上皮IGF-1及IGF-1R的mRNA表達(dá)量顯著升高。這可能是由于木薯淀粉在瘤胃中降解率較高，產(chǎn)生的能量較高，刺激了瘤胃上皮IGF-1的表達(dá)。所以，木薯淀粉開食料可能是通過(guò)IGF-1信號(hào)途徑，加速了細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)了羔羊瘤胃上皮的發(fā)育。

4 結(jié)論

含有較高支鏈淀粉(木薯淀粉)開食料在瘤胃中較易發(fā)酵生成VFA，促進(jìn)了瘤胃上皮IGF-1及細(xì)胞周期蛋白mRNA的表達(dá)，增加了斷奶前羔羊瘤胃乳頭的長(zhǎng)度、寬度和表面積。研究結(jié)果為制訂羔羊營(yíng)養(yǎng)方案具有重要指導(dǎo)意義。