李羽翡，張德榮，劉 煜，吳霞明，王建軍，祖 新，段 鵬

(1甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，蘭州 730030；2西北民族大學(xué)甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030)

諾如病毒是食源性疾病的主要病原之一，全球每年約有300萬(wàn)人群感染諾如病毒。諾如病毒傳播途徑多樣，可通過糞口途徑傳播，也可通過攝入污染的食物和水，以及感染病人、物體或表面接觸傳染，并且環(huán)境抵抗力強(qiáng)、感染劑量低、傳染性強(qiáng)、傳播能力廣[1-6]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，18個(gè)諾如病毒粒子就可以致病，抵抗力較弱的兒童、老人是該病毒的易感高危人群。諾如病毒極易在半封閉的場(chǎng)所內(nèi)爆發(fā)，容易造成群體性疫情。

近年來(lái)，諾如病毒感染事件越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。我國(guó)已經(jīng)有多起諾如病毒聚集性暴發(fā)事件報(bào)道，但多是基于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)分析和病人的檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)污染源頭、污染量，尤其是對(duì)有關(guān)食品中諾如病毒監(jiān)測(cè)報(bào)道較少，部分研究數(shù)據(jù)只能借鑒國(guó)外相關(guān)報(bào)道[7-9]。

本文對(duì)蘭州地區(qū)可能被該病毒污染的食品如海鮮類(牡蠣、貽貝、蝦、海螺、扇貝)、生食水果(圣女果、草莓、藍(lán)莓)、蔬菜(生菜、乳瓜)等進(jìn)行抽樣檢測(cè)、分析與數(shù)據(jù)匯總。對(duì)于掌握蘭州地區(qū)海鮮食品等諾如病毒的污染狀況、發(fā)現(xiàn)食品安全隱患以及評(píng)價(jià)食品經(jīng)營(yíng)加工環(huán)節(jié)諾如病毒污染控制水平等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑盒采用Permerdesign Norovirus Genogroup 1 and 2 Genesig Easy Kit 2 Target Gene Kit，北京科奧明生物技術(shù)有限公司，配套使用oasig Lyophilised One Step QRT-PCR Mastermix 凍干型一步法qRT-PCR預(yù)混液。病毒RNA提取試劑盒(Roche High pure Viral RNA Kit)、蛋白酶K(Proteinase K，recombinant PCR Grade)，德國(guó)羅氏；諾如病毒陽(yáng)性質(zhì)控球，中國(guó)食品藥品檢定研究院；果膠酶，美國(guó)Sigma；牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸鹽(PBS)緩沖液(gibco)，Life Technologies corporation；聚乙二醇(PEG8000)，上海生工生物工程股份有限公司；Tris鹽酸鹽(Vetec reagent grade，≥99%)，西格瑪；甘氨酸、氯化鈉(優(yōu)級(jí)純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ViiATM7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI)、MagNA Pure LC 2.0核酸提取儀(美國(guó)羅氏)、OPTI-MAIR生物安全柜(新加坡 ESCO)、MEGAFUGE8R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾)、SIM-F140ADL制冰機(jī)(日本松下)、MAXQ420HP搖床(美國(guó)賽默飛世爾)、MS205DU電子天平(瑞士梅特勒)、電磨勻漿器、生物安全柜等。

1.3 樣品采集

于2017年6月—2018年3月期間采集市售貝類海鮮(包括生蠔、貽貝、扇貝、蝦、海螺等)、蔬菜水果(包括生菜、乳瓜、藍(lán)莓、草莓、圣女果等)共計(jì)120份(表1)，樣品采集原則：每個(gè)采樣點(diǎn)采集樣品不超過3件。以6～8個(gè)貝類樣品作為1件樣品，較小貝類，由于其消化腺也小，10～12件貝類作為1件樣品，最終保證每件樣品解剖后消化腺和腸道的總重量≥2.0g。蔬菜、水果樣品以1 000g為1份，采集的新鮮樣品應(yīng)低溫保存，防止變質(zhì)。樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即處理，若不及時(shí)處理，應(yīng)冰箱保存，24h內(nèi)進(jìn)行處理并檢測(cè)。

表1 樣品采集明細(xì)

1.4 方法

1.4.1樣品前處理

(1)貝類海鮮樣品：取5～10個(gè)貝類進(jìn)行解剖，取其消化腺和腸道總質(zhì)量2.0g于15mL離心管，加入2mLPBS緩沖液、10μL濃度為20mg/mL蛋白酶K溶液，37℃，320r/min振蕩1h進(jìn)行消化。然后恒溫水浴60℃，保持15min，后3 000g離心5min，取上清液200μL進(jìn)行后續(xù)的RNA提取，提取過程采用High pure Viral RNA Kit試劑盒，操作過程按說(shuō)明書進(jìn)行。樣品提取過程中均要加入過程控制病毒MS2噬菌體，作為外加擴(kuò)增控制。

(2)蔬菜樣品：將新鮮菜葉剪至2cm2左右，直接稱取25g，放入帶有濾膜的無(wú)菌取樣袋內(nèi)，加入40mL TEBG (Tris/甘氨酸/牛肉膏)buffer，室溫?fù)u晃20min，將均質(zhì)袋濾膜一側(cè)的液體全部轉(zhuǎn)移至1支50mL離心管，4℃條件下，10 000×g，離心30min。離心后將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，并加入1/4倍體積的5×PEG/NaCl溶液，4℃條件下?lián)u晃60min，并10 000×g，離心30min。離心結(jié)束，棄上清液，繼續(xù)4℃條件下，10 000×g，離心5min壓實(shí)沉淀。離心結(jié)束，向沉淀加入500μL PBS溶液溶解沉淀，進(jìn)行后續(xù)的RNA提取，提取過程采用High pure Viral RNA Kit試劑盒。樣品提取過程中均要加入過程控制病毒MS2噬菌體。

(3)水果樣品：將水果樣品剪至2cm3左右的小塊，直接稱取25g，放入帶有濾膜的無(wú)菌取樣袋內(nèi)。加入30μ/mL的果膠酶溶液2mL，后續(xù)操作同蔬菜，然后進(jìn)行RNA提取，提取過程采用High pure Viral RNA Kit試劑盒。樣品提取過程中均要加入過程控制病毒MS2噬菌體。

1.4.2RNA提取與純化 使用羅氏High pure Viral RNA Kit試劑盒，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，提取物在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ赗NA的提取過程中，所有樣品均添加4μL外加擴(kuò)增控制RNA(MS2噬菌體提取的RNA)。

1.4.3Real-time RT-PCR檢測(cè)

(1)反應(yīng)體系的配制：選用GI和GII兩套引物探針體系分別進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體系20μL，其中Mastermix 10μL，NOROVIRUS引物探針混合物1μL，過程控制病毒或外加擴(kuò)增控制RNA引物探針混合物1μL、水3μL、模板RNA5μL。

(2)反應(yīng)條件的設(shè)置：55℃，10 min(逆轉(zhuǎn)錄)；95℃，2min(預(yù)變性)；95℃，10秒(變性)；60℃，60秒(數(shù)據(jù)采集)；其中變形、數(shù)據(jù)采集為50個(gè)循環(huán)。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 分別吸取90μL模板制備液到4個(gè)EP管中，標(biāo)記為2～5；吸取10μL陽(yáng)性對(duì)照到2號(hào)管，充分混勻；從2號(hào)管吸取10μL到3號(hào)管，充分混勻，依次重復(fù)上述步驟，完成梯度稀釋。1～5號(hào)管則濃度梯度分別為2×105/μL、2×104/μL、2×103/μL、2×102/μL、20/μL。擴(kuò)增曲線如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)擴(kuò)增溶解曲線

1.4.5結(jié)果的判斷 結(jié)合樣品Ct值、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照、過程控制病毒以及外加擴(kuò)增控制RNA綜合判定結(jié)果(表2)，防止假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝類海鮮中污染監(jiān)測(cè)

通過80份貝類海鮮樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線分析發(fā)現(xiàn)，5份陽(yáng)性標(biāo)本均為GII型，匯總結(jié)果顯示陽(yáng)性樣品為生蠔和貽貝，且貽貝的檢出率高達(dá)20%(表3)。

圖2為實(shí)際樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，陽(yáng)性樣品濃度在2×102～20/μL之間。由于諾如病毒致病劑量較低，10～100個(gè)病毒即可致病，因此該濃度的陽(yáng)性樣本足以引起一次諾如病毒感染事件。

表2 結(jié)果判讀依據(jù)

表3 120份樣品中諾如病毒檢測(cè)結(jié)果

圖2 實(shí)際樣品擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線

2.2 蔬菜水果中諾如病毒污染監(jiān)測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采集并檢測(cè)蔬菜、水果樣本共計(jì)40個(gè)，未檢測(cè)到陽(yáng)性樣品。

3 討論

甘肅地處西北，食品中諾如病毒的檢測(cè)工作尚未開展，因此，掌握蘭州地區(qū)海鮮等食品中諾如病毒的污染情況及發(fā)展趨勢(shì)，確定危害分布因素和可能來(lái)源具有重要意義。本研究首次對(duì)蘭州地區(qū)貝類海鮮、蔬菜水果中的諾如病毒進(jìn)行檢測(cè)篩查，為預(yù)測(cè)諾如病毒的污染狀況、了解食品安全狀況及發(fā)現(xiàn)食品安全隱患提供了科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)方法包含陽(yáng)性對(duì)照模板，作為反應(yīng)的對(duì)照及定量標(biāo)準(zhǔn)，利用陽(yáng)性對(duì)照模板生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得Ct值。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，以證明實(shí)驗(yàn)方案中的引物、探針設(shè)計(jì)合理；反應(yīng)體系、程序執(zhí)行無(wú)誤。同時(shí)在加樣過程中，將陽(yáng)性對(duì)照模板置于PCR加樣室，在加完待測(cè)樣品、空白對(duì)照并密封后再加入陽(yáng)性對(duì)照模板，可利于避免陽(yáng)性對(duì)照模板造成交叉污染。每次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置空白對(duì)照，以水為模板，以保證所測(cè)陽(yáng)性樣品的真實(shí)有效，反應(yīng)體系未受污染。為證明提取實(shí)驗(yàn)基于的生物樣本為有效樣本，選取大腸桿菌內(nèi)源基因設(shè)計(jì)引物，探針進(jìn)行提取擴(kuò)增；若內(nèi)源基因信號(hào)較弱，指示原始樣本未含有足夠的生物成分。使用MS2噬菌體過程控制病毒以及外加擴(kuò)增控制MS2RNA作為核酸提取實(shí)驗(yàn)是否成功以及RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否成功的參照；綜合考慮樣品Ct值、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照、過程控制病毒以及外加擴(kuò)增控制RNA的結(jié)果，最終判定結(jié)論，防止了假陽(yáng)性假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

我國(guó)時(shí)有諾如病毒食物中毒爆發(fā)事件報(bào)道。但目前對(duì)諾如病毒污染食品的種類、污染水平、病毒型別的研究尚不全面[10-13]。諾如病毒在實(shí)際食品檢測(cè)中含量較低，在一些樣品中的回收率極低[14]，由于諾如病毒在食品中不能復(fù)制繁殖，所以在體外培養(yǎng)基本不能實(shí)現(xiàn)，在食品中更不能復(fù)制繁殖、也沒有針對(duì)諾如病毒的疫苗。食品中的諾如病毒主要源自糞便、污水污染，病毒濃度均很低。檢測(cè)食品中諾如病毒的方法主要是通過遺傳物質(zhì)擴(kuò)增或抗原識(shí)別等方法，其中核酸擴(kuò)增方法因靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)為多個(gè)國(guó)際機(jī)構(gòu)廣泛使用[15-16]。

本研究顯示，蘭州和沿海城市一樣存在諾如病毒爆發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此，要加強(qiáng)對(duì)食品安全管理的力度，通過各種媒體渠道廣泛普及食品安全知識(shí)，提高民眾預(yù)防食源性疾病的安全防控意識(shí)。相關(guān)研究單位也應(yīng)更廣泛的開展數(shù)據(jù)調(diào)研，從而獲得更全面的食源性病毒污染狀況與食品安全調(diào)查資料，為人民群眾的身體健康、生命安全保駕護(hù)航?！?/p>