林媛，張紅娟，韓燕星，蔣建東

小檗堿（berberine，C20H19NO5，Mw 336.37）是一種具有廣泛藥理作用的異喹啉類生物堿，在體內(nèi)可以發(fā)揮降糖、降脂、抗氧化、抗感染等多種功能[1-2]。其中，小檗堿對(duì)腸道細(xì)菌感染的治療作用是最早被人們認(rèn)識(shí)并運(yùn)用到臨床當(dāng)中的[3]。而小檗堿治療腸道細(xì)菌感染的基礎(chǔ)是其容易集留在腸道中，并且有利于改善腸道菌的菌群失衡[4]。

腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的由多種細(xì)菌共同組成的菌群系統(tǒng)，參與機(jī)體的多種生理過程。早期研究中，腸道菌群更多的被認(rèn)為是和消化、營養(yǎng)吸收密切相關(guān)。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)腸道菌群還和人體的健康密切相關(guān)，比如能通過自身屏障影響機(jī)體免疫，菌群失調(diào)與糖尿病、心血管疾病、肥胖等代謝性疾病有重要關(guān)系等[5-6]。腸道菌群更像是一個(gè)隱形的“器官”，影響著人類的健康。腸道菌群種類繁多，包括腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、芽孢桿菌等。在這些腸道菌中，大部分都屬于專性厭氧菌，也是共生菌。還有少數(shù)一些細(xì)菌屬于致病菌，比如導(dǎo)致腹瀉的痢疾志賀菌、弗氏志賀菌，引起食物中毒的沙門菌等[7]。

本文通過測(cè)定小檗堿對(duì)多種腸道微生物的體外抑制作用，以及小檗堿對(duì)代表性腸道菌群生長(zhǎng)曲線的影響，為小檗堿與腸道菌的相互作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 鹽酸小檗堿購于中國藥品生物制品檢定研究院；左氧氟沙星（Levo）購于美國Sigma 公司；LB、NB、MRS、TSA、RCM 微生物培養(yǎng)基均購于美國 BD 公司。

1.1.2 菌株 沙門菌、弗氏志賀菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌、丁酸梭菌均購買于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）；痢疾志賀菌、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、阿氏腸桿菌、陰溝腸桿菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特菌購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.1.3 儀器 Orion Model 828 型電子 pH 計(jì)為德國 Sartorius 公司產(chǎn)品；MCV-B161Sb 超凈工作臺(tái)為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；NBS Innova 4 落地式變溫?fù)u床購于德國 Eppendorf 公司；Spectrostar 分光光度計(jì)為德國 BMG Labtech 公司產(chǎn)品；AW 200SG 型厭氧培養(yǎng)箱購于英國 Electrotek 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 取冷凍干燥的待測(cè)菌株，在超凈工作臺(tái)中接入無菌的相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 搖床 180 r/min 過夜培養(yǎng)（需氧細(xì)菌在普通變溫?fù)u床中培養(yǎng)，厭氧細(xì)菌在厭氧箱搖床中培養(yǎng)）。

1.2.2 藥物溶液配置 將鹽酸小檗堿用 DMSO溶解，在超凈工作臺(tái)中以 0.22 μm 微孔濾膜濾過，配置成 5 mg/ml 的藥物儲(chǔ)存液。之后再用相應(yīng)的培養(yǎng)基倍比稀釋成 2.048、1.024、0.512、0.256、0.128、0.064、0.032、0.016 mg/ml 藥物使用液。左氧氟沙星也以相同的方法配置成 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 mg/ml 藥物使用液。同時(shí)設(shè)立不加小檗堿的相同濃度的 DMSO 溶液（也以相應(yīng)的培養(yǎng)基稀釋）作為空白對(duì)照。

1.2.3 小檗堿對(duì)不同腸道菌群最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 使用試管倍比稀釋法進(jìn)行測(cè)定。取無菌試管 9 支，每支加入 1 ml 待測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)液（106CFU/ml），第 1 支至第 8 支分別加入倍比稀釋的鹽酸小檗堿使用液 1 ml，至終濃度分別為1.024、0.512、0.256、0.128、0.064、0.032、0.016、0.008 mg/ml，第 9 支加入不加藥的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。左氧氟沙星也以同樣的方法稀釋至藥物終濃度為 0.016、0.008、0.004、0.002、0.001、0.0005 mg/ml。將各個(gè)試管分別置于 37 ℃ 搖床中振蕩過夜培養(yǎng)。12 h 后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。與空白對(duì)照相比，液體清澈為有抑菌活性，混濁為有細(xì)菌生長(zhǎng)。無細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度即為 MIC 值。

1.2.4 小檗堿對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響 選取有代表意義的 4 株菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923、痢疾志賀菌 CICC10983、弗氏志賀菌ATCC12022、沙門菌 ATCC13076。將待測(cè)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋至 106CFU/ml。以鹽酸小檗堿 1/8、1/4、1/2 倍 MIC 作為加藥濃度，同時(shí)設(shè)立不加藥的空白對(duì)照。放入 37 ℃ 搖床中振蕩培養(yǎng)，在 0 ～ 12 h 每隔 1 小時(shí)取樣 0.5 ml。用分光光度計(jì)測(cè)量OD600值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制不同加藥濃度下細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)不同腸道菌的體外抑制作用

小檗堿對(duì) 24 株腸道菌包括需氧菌、厭氧菌，均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，尤其是對(duì)能夠引起腸道感染的痢疾志賀菌、弗氏志賀菌抑制作用較強(qiáng)（64 μg/ml），而對(duì)腸道正常菌群普通大腸桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌抑制作用較弱（＞ 1024 μg/ml）（表 1）。

表 1 小檗堿對(duì)不同腸道菌群的抑制作用Table 1 The inhibitory effects of berberine to intestinal bacteria

圖 1 小檗堿對(duì)腸道菌生長(zhǎng)曲線的影響（A：金黃色葡萄球菌；B：弗氏志賀菌；C：痢疾志賀菌；D：沙門菌）Figure 1 The effect of berberine on growth curve of intestinal bacteria (A: Staphylococcus aureus; B: Shigella flexneri; C: Shigella dysenteriae; D: Salmonella)

2.2 小檗堿對(duì)腸道菌生長(zhǎng)曲線的影響

選取具有代表意義的腸道菌金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、弗氏志賀菌、沙門菌為待測(cè)菌，繪制不同濃度下細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。由圖 1 可見，無論小檗堿濃度高低，所有加小檗堿的腸道菌生長(zhǎng)曲線在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期都位于對(duì)照組之下，表明小檗堿對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的 4 種腸道菌均產(chǎn)生了明顯的抑制作用，并且隨著小檗堿濃度的增高，其抑制作用也增強(qiáng)。由于高濃度小檗堿溶解性不好，影響了分光光度計(jì)對(duì)OD600的檢測(cè)，所以我們只測(cè)定了低于 MIC 的小檗堿濃度對(duì)腸道菌生長(zhǎng)的影響。在引起腸道細(xì)菌感染的痢疾志賀菌、弗氏志賀菌、沙門菌中，可以看到痢疾志賀菌生長(zhǎng)最快，弗氏志賀菌、沙門菌生長(zhǎng)相似且較為緩慢。加藥后，小檗堿對(duì)痢疾志賀菌的抑制也較為平緩，對(duì)弗氏志賀菌、沙門菌的抑制在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較大。小檗堿對(duì)痢疾志賀菌僅延長(zhǎng)遲緩期，幾乎不影響其倍增時(shí)間；但是對(duì)沙門菌和弗氏志賀菌則不同，小檗堿明顯增加了沙門菌和弗氏志賀菌的倍增時(shí)間。

3 討論

本文選取 24 株常見的腸道細(xì)菌，通過在體外測(cè)定鹽酸小檗堿的抑菌活性，可以看出小檗堿的抗菌活性并不強(qiáng)，其 MIC 大部分在 64 μg/ml 以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照藥左氧氟沙星。而臨床將小檗堿用于治療胃腸道感染卻有顯著的治療效果。我國將小檗堿用于臨床治療胃腸道感染的最早報(bào)道見于1957 年[8]，近幾十年來，廣大醫(yī)生和人民群眾都已經(jīng)將小檗堿作為非處方藥用于各種腹瀉的治療。大量研究結(jié)果表明，小檗堿治療胃腸道感染的機(jī)制，除了對(duì)致病腸道菌有一定的抑制作用之外，還在于小檗堿能夠改善腸道菌群的平衡、對(duì)胃腸道黏膜功能有保護(hù)作用[9]。通過本研究的測(cè)定也可以看出，小檗堿對(duì)腸道菌群中的有害菌（痢疾志賀菌、弗氏志賀菌、沙門菌等）的抑制作用較強(qiáng)。也有報(bào)道指出，小檗堿還能夠增加有益的腸道菌，如能夠增加具有短鏈脂肪酸（SCFA）產(chǎn)生功能的Blautia和allobaculum等菌屬，而 SCFA 能夠調(diào)節(jié)腸道 pH值、抗炎、調(diào)節(jié)人體代謝與免疫[4]。

MIC 值是一個(gè)常用的反映藥物對(duì)細(xì)菌抑制作用的數(shù)值[10]，但不能反映藥物對(duì)細(xì)菌整個(gè)生長(zhǎng)周期的影響。本文通過繪制小檗堿對(duì) 4 種代表性腸道菌作用的生長(zhǎng)曲線，動(dòng)態(tài)地反映了小檗堿作用 0 ～12 h 范圍內(nèi)對(duì) 4 種腸道菌的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，我們可以看到，小檗堿對(duì)痢疾志賀菌僅延長(zhǎng)遲緩期，幾乎不影響其倍增時(shí)間；但是對(duì)沙門菌和弗氏志賀菌則不同，小檗堿明顯增加了兩者的倍增時(shí)間。推測(cè)其原因，有可能是小檗堿通過對(duì)痢疾志賀菌某些基因的調(diào)控導(dǎo)致其在遲緩期的代謝受到抑制。而對(duì)于沙門菌和弗氏志賀菌，小檗堿可能主要影響其分裂期的相關(guān)基因表達(dá)或者酶的活性。具體作用機(jī)制，需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入驗(yàn)證。本研究為今后探討小檗堿抑制腸道菌生長(zhǎng)的規(guī)律以及小檗堿與腸道菌相互作用提供一定參考。