舒雄，杰永生，鄭蕊，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊

關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上的常見(jiàn)病，由于缺乏血供、淋巴和可遷移、增殖的未分化細(xì)胞，因而其自身修復(fù)與再生能力極為有限。臨床上治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的外科手術(shù)治療方法包括：自體軟骨移植、異體軟骨移植、微骨折技術(shù)等[1-2]，但這些都不同程度地存在著修復(fù)組織早期退變、供體來(lái)源受限、修復(fù)能力有限等問(wèn)題，不能從根本上解決軟骨損傷治療的難題。目前，組織工程策略為軟骨修復(fù)帶來(lái)了新的希望。相比骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞特性而言，脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞易于分離和大量獲取，同時(shí)具有更好的分離重復(fù)性和更強(qiáng)的增殖能力，一直被認(rèn)為是最適合臨床應(yīng)用的細(xì)胞[3-4]。富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是一種來(lái)自全血的自體衍生物，是將新鮮血液離心、分離后獲得的含有高濃度血小板的血漿，PRP 可被凝血酶或鈣離子激活，激活后的 PRP 能大量釋放多種不同的生長(zhǎng)因子，其中包括：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等[5]。PRP 由于其來(lái)源豐富、制備簡(jiǎn)便、療效顯著且全面，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化和損傷組織的愈合中發(fā)揮重要作用。此外，先前軟骨再生研究中表明，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（FGF-2）[6]、IGF-1[7]、TGF-β3[8]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6（BMP-6）[9]等在間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。因此，近些年對(duì) PRP 治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。另外，對(duì)于脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞，合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系也起到至關(guān)重要的作用。Pellet 培養(yǎng)體系作為無(wú)支架培養(yǎng)的代表，令長(zhǎng)期培養(yǎng)中的軟骨細(xì)胞保持較好生物學(xué)活性[10]?？紤]到上述細(xì)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)以人脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，篩選不同比例激活 PRP 濃度比較成軟骨效果的差異，探索是否有比激活 PRP誘導(dǎo)效果更好的培養(yǎng)體系，為下一步臨床利用 PRP復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 人脂肪組織來(lái)源于北京知音創(chuàng)美醫(yī)療美容門(mén)診部吸脂者，女性，抽吸部位為腹部，術(shù)后無(wú)菌保存。I 型膠原酶、胰酶、Trizol 試劑、高糖 DMEM、低糖 DMEM 和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；CaCl2溶液、阿利新藍(lán)染料、番紅 O 染料購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；地塞米松、ITS+ 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；TGF-β3 購(gòu)自 Pepro Tech 公司；cDNA Synthesis SuperMix 和UltraSYBR Mixture 購(gòu)自日本 Takara 公司；Sox-9、Gli-1 和 BMP-2 抗體購(gòu)自美國(guó) CST 公司；HRP-羊抗鼠 IgG 和 HRP-驢抗兔二抗購(gòu)自 Jackson 公司；糖胺多糖（GAG）總含量二甲基亞甲基藍(lán)比色法定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó) Shellab 公司產(chǎn)品；往復(fù)式真空泵為上海益化真空設(shè)備有限公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；冷凍大容量離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；熒光定量 PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；Nanodrop ND-2000 分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs 的分離及培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下取脂肪組織，將脂肪組織在 PBS 中清洗 3 次，徹底去除紅細(xì)胞與脂肪組織碎片。按照課題組之前報(bào)道分離脂肪干細(xì)胞步驟進(jìn)行[11]，調(diào)整細(xì)胞密度接種于含 10% FBS 和 1% 的青、鏈霉素的低糖 DMEM培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞增殖達(dá)到 80% ～ 90% 融合，取 P3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用。

1.2.2 激活 PRP 制備和分離 預(yù)裝有 5 ml 枸櫞酸鈉抗凝劑的 50 ml 一次性注射器經(jīng)肘前靜脈抽取志愿者血液 45 ml，溫柔振蕩，使血液與抗凝劑充分混勻，取 0.5 ml PRP 血小板計(jì)數(shù)。將剩余血液 4 ℃，1070 r/min 離心 20 min，離心后管內(nèi)液體分為 3 層，上層血漿、中間為白膜層、下層為紅細(xì)胞層。小心吸取上層血漿、中間層白膜及1 mm 紅細(xì)胞層轉(zhuǎn)至另一離心管內(nèi)。再次將離心管置于離心機(jī)內(nèi)，4 ℃，2130 r/min 離心 10 min，可見(jiàn)離心管上層為淡黃色透明血漿及貧血小板血漿（PPP），下層為灰白色血小板沉淀及少量紅細(xì)胞沉淀，將全部液體上部 3/4 棄除，剩余部分吹打混勻，約為全血體積的 1/8。取 0.5 ml PRP 用于血小板計(jì)數(shù)。隨后 10% CaCl2與 PRP 1∶9 的比例迅速混勻，37 ℃ 放置 1 h 后置于 4 ℃ 冰箱過(guò)夜。次日見(jiàn)大量淡黃色澄清液體析出，即為激活態(tài)PRP。將試管置于離心機(jī)內(nèi)，4 ℃，5000 r/min 離心 30 min。將上清液小心分裝至 0.5 ml EP 管內(nèi)，若長(zhǎng)期儲(chǔ)存需置于 –80 ℃ 冰箱內(nèi)。

1.2.3 激活的 PRP 對(duì) hADSCs 增殖實(shí)驗(yàn) 將P3代 hADSCs 重懸計(jì)數(shù)，加入 96 孔板，每孔 5 ×103個(gè)細(xì)胞，貼壁后換液，分別加入 100 μl 的含5%、10% 和 15% PRP 的 DMEM/F12，對(duì)照組加入含 10% 的 FBS，分別按照所需的時(shí)間點(diǎn)觀察。每孔加入 20 μl 的 MTT，孵育 4 h 后，加入 150 μl DMSO 終止反應(yīng)，490 nm 測(cè)定吸收值。

1.2.4 Pellet 培養(yǎng)細(xì)胞微球 將 P3代 hADSCs重懸計(jì)數(shù)，在每個(gè) 15 ml 離心管中加入 2.5 × 105個(gè)細(xì)胞，300 ×g離心 5 min，分為 3 組：①對(duì)照組：2 ml 的高糖 DMEM 中加入 100 U/ml 青、鏈霉素、10% FBS。②激活 PRP 組：2 ml 的高糖 DMEM中加入 100 U/ml 青、鏈霉素、10% FBS 和 10%激活 PRP。③軟骨誘導(dǎo)組：2 ml 完全軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分為：高糖 DMEM 中加入 100 U/ml青、鏈霉素、10% FBS、10 nmol/L 地塞米松、10 ng/ml TGF-β3、ITS+（含 6.25 μg/ml 胰島素、6.25 μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25 μg/ml 亞硒酸、5.33 μg/ml 亞油酸、1.25 mg/ml BSA）。24 h 后細(xì)胞聚集成球，每隔2 天全量換液，按照所需要時(shí)間培養(yǎng)后，收獲細(xì)胞。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)基因表達(dá) 各組Pellet 培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò) Trizol 法提取總 RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和 real-time PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；55 ℃，1 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 1 min。檢測(cè)相關(guān)目的基因，以 GAPDH 為內(nèi)參基因，各引物序列見(jiàn)表 1，采用 ΔΔCt 法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 組織學(xué)染色 各組 Pellet 培養(yǎng)細(xì)胞，PBS洗 1 次，4% 多聚甲醛 4 ℃ 固定過(guò)夜，脫水切片，分別進(jìn)行阿利新藍(lán)染色和蘇木精-伊紅染色，在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.7 糖胺多糖含量測(cè)定 將各組 Pellet 培養(yǎng)細(xì)胞留存的組織消化液 50 μl 加入 96 孔板，另外加入 200 μl 預(yù)先配置好的二甲基亞甲基藍(lán)（DMMB）染色液。利用 DMMB 比色法測(cè)定糖胺多糖的含量，實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù) GENEMD 糖胺多糖總含量二甲基亞甲基藍(lán)比色法定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表 1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.2.8 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組Pellet 培養(yǎng)通過(guò) RIPA 裂解后，BCA 定量，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，采用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到 PVDF 上。將 PVDF 膜在5% 的脫脂奶（溶于 PBS，pH 7.4）中，4 ℃ 封閉過(guò)夜，與 Gli-1、BMP-2 和 Sox-9 的一抗常溫下孵育 1 h，TBST 洗膜 5 次后分別加入 HRP 驢抗兔 IgG 和 HRP 羊抗鼠 IgG（1∶1000）在常溫下孵育 1 h。TBST 洗膜 5 次后，用 ECL 發(fā)光試劑盒顯影和定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組所得計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，用 SPSS 10.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α = 0.05，P＜ 0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激活的 PRP 有效促進(jìn) hADSCs 的增殖

為了評(píng)價(jià)激活不同比例 PRP 對(duì) hADSCs 增殖能力的影響，采用 MTT 實(shí)驗(yàn)方法篩選合適的激活 PRP 比例。激活不同比例（5%、10% 和 15%）的 PRP 分別刺激已成功分離純化和鑒定的hADSCs，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多角形和斡旋狀排列，而且與對(duì)照組形態(tài)十分相似（圖 1A ～ D）。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，3 d 后不同比例激活PRP 開(kāi)始促進(jìn) hADSCs 的增殖，7 d 后不同比例激活 PRP 促 hADSCs 增殖具有顯著差異。但是，10% PRP 與 15% PRP 之間差異不顯著。因此，10% 激活的 PRP 對(duì)促進(jìn) hADSCs 的增殖促進(jìn)最佳。

圖 1 激活 PRP 刺激人脂肪干細(xì)胞增殖（A：5% PRP；B：10% PRP；C：15% PRP；D：對(duì)照組；E：不同比例激活 PRP 促進(jìn) hADSCs 增殖能力）Figure 1 Activated PRP increased hADSCs proliferation (A: 5% PRP; B: 10% PRP; C: 15% PRP; D: Control group; E: The proliferation ability of hADSCs by different proportions activated PRP)

2.2 激活 PRP 刺激 Pellet 培養(yǎng) hADSCs 的組織學(xué)評(píng)價(jià)

激活 PRP 組和軟骨誘導(dǎo)組分別在 Pellet 培養(yǎng) 21 d 后，發(fā)現(xiàn)激活 PRP 組與軟骨誘導(dǎo)組刺激hADSCs 向軟骨細(xì)胞分化的表達(dá)程度水平相似，同時(shí)誘導(dǎo)分化 hADSCs 的軟骨特異性染色阿利新藍(lán)呈陽(yáng)性，證實(shí)其兩組分化表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖表達(dá)呈陽(yáng)性，但相比較而言軟骨誘導(dǎo)組的陽(yáng)性表達(dá)更強(qiáng)（圖 2）。

2.3 熒光定量 PCR 檢測(cè)激活 PRP 刺激 Pellet培養(yǎng) hADSCs 的軟骨相關(guān)基因表達(dá)

激活 PRP 組、軟骨誘導(dǎo)組和對(duì)照組在 Pellet培養(yǎng)條件刺激后連續(xù)培養(yǎng) 21 d，real-time PCR 檢測(cè) 3 組刺激 hADSCs 細(xì)胞團(tuán)塊中 Sox-9、Aggrecan 和 II 型膠原 mRNA 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)軟骨誘導(dǎo)組的 Sox-9、Aggrecan 和 II 型膠原 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于激活 PRP 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）（圖 3A）。

2.4 DMMB 檢測(cè)激活 PRP 刺激 Pellet 培養(yǎng)hADSCs 的 GAG 含量

按照 DMMB 比色法說(shuō)明書(shū)測(cè)定 GAG 的含量，對(duì)照組、激活 PRP 組和軟骨誘導(dǎo)組在 Pellet培養(yǎng)第 7 天、第 14 天和第 21 天 GAG 含量的表達(dá)。研究結(jié)果表明，第 7 天時(shí)，軟骨誘導(dǎo)組 GAG含量高于激活 PRP 組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第 14 天和第 21 天時(shí)，軟骨誘導(dǎo)組 GAG含量顯著高于激活 PRP 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）（圖 3B）。

圖 2 激活 PRP 和軟骨誘導(dǎo)組 Pellet 培養(yǎng) hADSCs 后組織學(xué)評(píng)價(jià)（× 40）（A：激活 PRP 組 H&E 染色；B：軟骨誘導(dǎo)組 H&E 染色；C：激活 PRP 組阿利新藍(lán)染色；D：軟骨誘導(dǎo)組阿利新藍(lán)染色）Figure 2 Histological evaluation of hADSCs after activated PRP and chondrogenic induction stimulation (× 40) (A: H&E staining of the activated PRP group; B: H&E staining of the chondrogenic induction group; C: Alcian blue staining of the activated PRP group; D: Alcian blue staining of the chondrogenic induction group)

圖 3 激活 PRP 和軟骨誘導(dǎo)刺激 hADSCs 軟骨特征的表現(xiàn)（A：Real-time PCR 測(cè)定各組軟骨分化相關(guān)基因 mRNA 的含量；B：DMMB 比色法測(cè)定各組 GAG 含量；*P ＜ 0.05）Figure 3 Activated PRP and chondrogenic induction stimulated hADSCs showed chondrogenic characteristics (A: Level of chondrogenic differentiation related genes mRNA in various groups by real-time PCR; B: Level of GAG in various groups by DMMB quantitative assay; *P ＜ 0.05)

2.5 Western blot 檢測(cè)激活 PRP 刺激 Pellet培養(yǎng) hADSCs 中 Sox-9、Gli-1 和 BMP-2 蛋白表達(dá)

為了進(jìn)一步探討激活 PRP 刺激 Pellet 培養(yǎng)hADSCs 對(duì) Hedgehog 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路串話(huà)調(diào)控軟骨細(xì)胞分化其相關(guān)信號(hào)通路的影響，對(duì)培養(yǎng) P3代的 hADSCs 細(xì)胞，分為對(duì)照組和激活 PRP 組，10% PRP 在 Pellet 培養(yǎng)刺激21 d 后，Western blot 檢測(cè)兩組細(xì)胞中 Sox-9、Gli-1以及 BMP-2 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，激活 PRP 組的 Gli-1 和 BMP-2 表達(dá)增強(qiáng)，而 Sox-9 蛋白表達(dá)水平相應(yīng)增加（圖 4）。說(shuō)明激活 PRP 中的各種生長(zhǎng)因子可通過(guò)激活 Hedgehog信號(hào)通路在 BMP 信號(hào)通路上游調(diào)控 hADSCs 成軟骨分化，這證實(shí) Hedgehog 通路與 BMP 通路在串話(huà)調(diào)控軟骨形成中相互聯(lián)系。

圖 4 激活 PRP 刺激人脂肪干細(xì)胞對(duì) Hedgehog 和 BMP信號(hào)通路的影響Figure 4 The effect of activated PRP on Hedgehog and BMP signaling pathway in hADSCs

3 討論

關(guān)節(jié)表面覆蓋一層透明軟骨，對(duì)關(guān)節(jié)功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。創(chuàng)傷、炎癥、退行性改變等造成關(guān)節(jié)軟骨缺損，如不及時(shí)治療，通常會(huì)引起全骨關(guān)節(jié)炎，然而受損的關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)和再生能力差，如何對(duì)缺損的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行修復(fù)，重建關(guān)節(jié)功能和防止關(guān)節(jié)退變，是在臨床方面遇到的挑戰(zhàn)。目前臨床治療骨關(guān)節(jié)炎主要采用對(duì)癥治療——關(guān)節(jié)腔沖洗、骨髓刺激和自體軟骨移植，雖然取得了一定的療效，但是上述方法均不能成功恢復(fù)正常的關(guān)節(jié)軟骨面，也就不能確保其長(zhǎng)期的功能恢復(fù)。

近年來(lái)，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，特別是以細(xì)胞治療為主的組織工程技術(shù)，給軟骨缺損的修復(fù)帶來(lái)了新思路[12]。實(shí)踐證明，由于自體軟骨細(xì)胞移植有諸多限制，從而限制了臨床應(yīng)用，而來(lái)源于不同組織的間充質(zhì)干細(xì)胞被用于組織工程修復(fù)的種子細(xì)胞，其中脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）因其來(lái)源廣泛、在體內(nèi)性能和含量穩(wěn)定、對(duì)機(jī)體損傷很小、培養(yǎng)條件較簡(jiǎn)單、增殖能力較強(qiáng)等特點(diǎn)被廣為關(guān)注。近年來(lái)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示 PRP 中富含高濃度的血小板，且含有多種生長(zhǎng)因子，如 PDGF、TGF-β、IGF、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，這些生長(zhǎng)因子參與肌腱、韌帶等組織修復(fù)的關(guān)鍵過(guò)程，尤其是在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)方面包括細(xì)胞增殖、趨化、遷移、分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成[13-15]。研究表明生長(zhǎng)因子對(duì)組織工程化軟骨的形成和軟骨細(xì)胞增殖、胞外基質(zhì)合成有著重要作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，首先將分離的 hADSCs 培養(yǎng)到P3后，抽取 50 ml 健康人靜脈血后用二次離心法制備出 PRP，加入氯化鈣獲得凝膠，離心得到激活 PRP 釋放物，然后以激活 5% PRP、10% PRP、15% PRP 和 10% FBS 分別作為培養(yǎng)基，7 d 后發(fā)現(xiàn)，與激活 5% PRP 和 10% FBS 相比較，激活10% 和 15% PRP 對(duì) hADSCs 的增殖具有顯著效果，但是兩者之間沒(méi)有顯著差異，故選定激活 10%PRP 作為 hADSCs 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的最佳比例。本實(shí)驗(yàn)研究中我們采用 Pellet 培養(yǎng)法，通過(guò)離心使細(xì)胞聚集成團(tuán)，人為創(chuàng)造一個(gè) 3D 的培養(yǎng)環(huán)境，這樣利于細(xì)胞外軟骨基質(zhì)形成。通過(guò)阿利新藍(lán)和 H&E的染色，激活 PRP 組和軟骨誘導(dǎo)組的染色顯陽(yáng)性，前者比后者陽(yáng)性表達(dá)顯低，進(jìn)一步采用熒光定量PCR 檢測(cè)其 Sox-9、Aggrecan 和 II 型膠原基因表達(dá)和 DMMB 法測(cè)定其 GAG 含量，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，激活 PRP 組 GAG 含量相對(duì)偏低，分析發(fā)現(xiàn)對(duì)于潛在的臨床應(yīng)用，采用多次自體激活 PRP可以替代商業(yè)化軟骨誘導(dǎo)劑，對(duì)保持軟骨分化狀態(tài)的維持更有利。最后我們研究激活 PRP 是如何調(diào)控 Sox-9 表達(dá)的機(jī)制促進(jìn) hADSCs 成軟骨樣分化，相比對(duì)照組來(lái)說(shuō)，結(jié)果顯示激活 PRP 的hADSCs 中 Gli-1 和 BMP-2 蛋白表述上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn) Sox-9 蛋白表達(dá)增強(qiáng)。該研究結(jié)果證明激活PRP 可以促進(jìn) Hedgehog 和 BMP 信號(hào)通路，增強(qiáng)Sox-9 基因的表達(dá)，維持脂肪干細(xì)胞分化而保持軟骨化的表型。

研究結(jié)果提示激活 PRP 刺激 hADSCs 可以提高干細(xì)胞的軟骨再生和降低經(jīng)濟(jì)成本。雖然在這項(xiàng)研究中探討了 hADSCs 分離制備后誘導(dǎo)成軟骨的臨床前相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)，但是，關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)是一個(gè)包括生長(zhǎng)因子參與的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)過(guò)程，涉及細(xì)胞、胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)內(nèi)分泌等，PRP 如何刺激 hADSCs 修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的具體機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)，PRP 復(fù)合 hADSCs 在動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用時(shí)間、頻率、方法、最適濃度和關(guān)節(jié)局部環(huán)境等有待闡明。