阮建 單雷 李新國 郭峰 孟靜靜 萬書波 彭振英

摘要：脂肪酸去飽和酶（FAD）是合成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，在植物維持各項生命活動、應對生物與非生物脅迫方面具有重要作用。本研究對花生基因組中的FAD基因家族進行鑒定與生物信息學分析，并利用花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對花生FAD（AhFAD）基因的表達模式及可變剪接形式進行分析。結(jié)果顯示，在花生基因組中共有31個AhFAD基因，分為6類，AhSAD基因亞家族有12條序列，AhFAD2有6條序列，AhFAD3有4條序列，AhFAD4/5有3條序列，AhFAD6有2條序列，AhFAD7/8有4條序列。聚類分析表明，AhFAD有兩大分支：游離AhSAD分支和膜結(jié)合AhFAD分支；膜結(jié)合AhFAD分支中AhFAD4/5起源最早，ω-3 AhFAD由ω-6 AhFAD進化而來；單雙子葉聚類于不同分支。表達模式分析表明，AhSAD、AhFAD2和AhFAD3在種子中表達水平較高，AhFAD4/5、AhFAD6、AhFAD7/8在葉中表達量最高。可變剪接分析表明，AhFAD亞家族之間可變剪接形式差異明顯，其中有12個AhFAD基因發(fā)生了可變剪接。TTS和TSS是發(fā)生最多的可變剪接事件，其次是IR，最少的是AE和ES。

關(guān)鍵詞：花生；脂肪酸去飽和酶（FAD）；生物信息學分析；表達模式；可變剪接

中圖分類號：S565.2：Q7文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）06-0001-09

Abstract Fatty acid desaturase （FAD） is a key enzyme in the synthesis of unsaturated fatty acids， which plays an important role in maintenance of various life activities of plants and in response to biotic and abiotic stresses. In this study， the peanut FAD （AhFAD） gene family were identified and conducted bioinformatics analysis in genome-wide range， and the expression pattern and alternative splicing forms of AhFADs were analyzed using peanut transcriptome data. The results showed that there were 31 AhFAD genes in peanut genome， which could be divided into 6 subfamilies. There were 12 members in AhSAD subfamily， 6 members in AhFAD2 subfamily， 4 members in AhFAD3 subfamily， 3 members in AhFAD4/5 subfamily， 2 members in AhFAD6 subfamily and 4 members in AhFAD7/8 subfamily. Clustering analysis showed that there were two major branches of AhFAD： free and membrane-binding AhFAD branch. In membrane-binding AhFAD branch， the origin of AhFAD4/5 was the earliest， the ω-3 AhFAD was evolved from ω-6 AhFAD， and the mono-dicotyledonous AhFAD was clustered in different branches. The expression levels of AhSAD， AhFAD2 and AhFAD3 in seeds were higher， while AhFAD4/5， AhFAD6 and AhFAD7/8 had the highest expression in leaves. The analysis of alternative splicing showed that there were significant differences in alternative splicing forms among the subfamilies of AhFAD， of which， 12 AhFAD genes had alternative splicing isoforms. TTS and TSS were the most frequent alternative splicing events， followed by IR， and the fewest ones were AE and ES.

Keywords Peanut； Fatty acid desaturase （FAD）； Bioinformatics analysis； Expression pattern； Alternative splicing

脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）是由碳、氫、氧三種元素組成的一端含有一個羧基的長脂肪族碳氫鏈，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分，在維持機體代謝、參與細胞信號識別和組織免疫應答、應對各種環(huán)境脅迫等方面具有重要作用[1]。根據(jù)碳氫鏈的飽和程度不同，F(xiàn)A分為飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）兩類。根據(jù)UFA雙鍵個數(shù)的不同，分為單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA，含有一個雙鍵，主要有棕櫚油酸和油酸）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA，含兩個或兩個以上雙鍵）[2]。PUFA是動物和人類的必需脂肪酸，自身不能合成，必須通過攝取外源不飽和脂肪酸來維持機體正常運行[3]。

脂肪酸去飽和酶（FAD）是形成UFA的關(guān)鍵酶，它可以在SFA的基礎上引入單個或多個不飽和鍵。植物體內(nèi)FAD可以分為兩大類：游離的硬脂酰-ACP去飽和酶（△9-SAD）和膜結(jié)合脂酰-脂去飽和酶FAD[4-6]。根據(jù)位置不同可將膜結(jié)合FAD分為質(zhì)體FAD（FAD4、FAD5、FAD6、FAD7、FAD8）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)FAD（FAD2和FAD3）。SAD作用于硬脂酰-ACP，F(xiàn)AD4和FAD5作用于脂酰-脂中C16∶0脂肪酸[7]；ω-6 FAD（FAD2和FAD6）和ω-3 FAD（FAD3、FAD7、FAD8）在脂酰-脂中分別引入第二個和第三個雙鍵，其中ω-6 FAD以C18∶1為底物[8， 9]；ω-3 FAD以C16∶2或C18∶2為底物[10]。

△9-SAD屬于脂酰-ACP去飽和酶家族，底物是硬脂酰-ACP，在質(zhì)體內(nèi)通過氧化還原過程在C9位和C10位之間引入第一個雙鍵，將C18∶0催化為C18∶1從而增加C18∶1含量[7]；ω-6 FAD將C18∶1△9轉(zhuǎn)化為C18∶2△9，12，ω-3 FAD催化C18∶2△9，12形成C18∶3△9，12，15；FAD4和FAD5在脂酰-脂中將C16∶0氧化為C16∶1△7；在糖脂中FAD6還能將C16∶1△7氧化為C16∶2，F(xiàn)AD7和FAD8能促進C16∶2向C16∶3脂肪酸轉(zhuǎn)化[11]。

基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯過程發(fā)揮功能，mRNA前體可通過不同的剪接形式產(chǎn)生多種mRNA剪接異構(gòu)體，這一過程稱為可變剪接（alternative splicing，AS）[12]。可變剪接是基因轉(zhuǎn)錄后編輯的重要形式，是基因表達調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)多樣性的重要機制，是導致基因和蛋白質(zhì)數(shù)量差異的重要因素之一?？勺兗艚佑?種基本形式：內(nèi)含子保留（intron retention，IR）、外顯子跳躍（exon skipping，ES）、外顯子5′或3′端可變剪接（alternative 5′or 3′ exon ends，5′-AE or 3′-AE）、轉(zhuǎn)錄起始位置可變剪接（alternative transcription start site，TSS）和轉(zhuǎn)錄終止位置可變剪接（alternative transcription terminal site，TTS）。動物和酵母中，ES是主要的可變剪接形式[13]，而在植物中IR占主要地位[14]。據(jù)報道，在鼠、豬、狗、狐貍、雞和馬等動物中，F(xiàn)AD具有多種可變剪接異構(gòu)體，其表達模式各不相同[3，15]，但是對于它們在油脂合成中的功能卻沒有進行深入研究。

花生是我國重要的油料作物之一，籽粒含油量一般在50%左右，95%的油脂以三酰甘油（triacylgycerol，TAG）的形式貯存，其中C18∶1和C18∶2占整個油脂組分的80%，油亞比大約在1左右[16-18]。目前針對花生育種開展較多的工作是高產(chǎn)和高油酸育種，部分AhFAD基因已被克隆并進行了功能驗證，但是關(guān)于該家族的系統(tǒng)分析卻很少[19，20]。本研究利用花生基因組數(shù)據(jù)庫[21]，對AhFAD基因家族的進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位及表達模式、可變剪接等進行分析，為利用分子技術(shù)改良花生品種提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 AhFAD基因檢索

根據(jù)NCBI公布的花生及其他豆科植物FAD基因序列，在花生基因組數(shù)據(jù)庫Peanutbase（https：//www.peanutbase.org/）進行檢索。將檢索得到的全部基因序列及其基因組序列下載，以FASTA格式進行保存，并將cDNA翻譯成氨基酸序列進行分析。

1.2 AhFAD的生物信息學分析

根據(jù)AhFAD氨基酸序列信息，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源檢索，檢索條件設置為Ident>75%，檢索物種為：麻風樹（Jatropha curcas，Jcu）、鷹嘴豆（Cicer arietinum，Car）、大豆（Glycine max，Gma）、蓖麻（Ricinus communis，Rco）、可可（Theobroma cacao，Tca）、木豆（Cajanus cajan，Cca）、白毛楊（Populus tomentosa，Pto）、哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica，Hum）、南瓜（Cucurbita moschata，Cmo）、綠豆（Vigna radiata，Vra）、狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius，Lan）、棉豆（Phaseo luslunatus，Plu）、野大豆（Glycine soja，Gso）、赤豆（Vigna angularis，Van）、川桑（Morus notabilis，Mno）、棗（Ziziphus jujuba，Zju）、巴旦木（Prunus persica，Ppe）、棉花（Gossypium raimondii，Gra）、毛果楊（Populus trichocarpa，Ptr）、核桃（Juglans regia，Jre）、巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis，Hbr）、玉米（Zea mays，Zma）、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu，Tur）、粳稻（Oryza sativa，Os）、粟米（Setaria italica，Sit）、高粱（Sorghum bicolor，Sbi）、短花藥野生稻（O. brachyantha，Obr）、鳳梨（Ananas comosus，Aco）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschi，Ata）。去除同物種重復基因序列后將AhFAD序列與其他物種FAD進行比對分析，利用Mega6軟件使用鄰近法構(gòu)建進化樹，置信度通過1 000次自展重復計算。利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件分析AhFAD跨膜結(jié)構(gòu)域；利用TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在線軟件分析AhFAD亞細胞定位；利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線軟件分析AhFAD保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 AhFAD的表達量和可變剪接分析

根據(jù)花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（NCBI： PRJNA354652）中AhFAD的FPKM值，用HemI軟件進行表達模式分析。用ASTALAVISTA program （http：//genome.crg.es/astalavista/）分析其可變剪接情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhFAD基因家族的生物信息學分析

在花生基因組數(shù)據(jù)庫中進行基因序列檢索，共獲得31條AhFAD序列，其中AhSAD有12條序列，AhFAD2有6條序列，AhFAD3有4條序列，3條AhFAD4/5序列，2條AhFAD6序列，4條AhFAD7/8序列（表1）。4條序列（Aradu.7W39T、Araip.31Q5V、Araip.CD8XS、Aradu.C4479）的CDS不是從ATG起始密碼子開始，N端序列缺失；2條序列（Araip.GX1CD和Aradu.L1M1M）沒有預測到終止密碼子，C端序列缺失；2條序列（Araip.65EGG和Aradu.UT0N9）相較于其他序列很短。

2.2 31個AhFAD的基因組分布

從表1可以看出，這31個基因位于15條染色體的不同位置，其中A基因組中有15個，不均勻地分布于8條染色體上，Aradu.02、Aradu.08和Aradu.09上各有3個，Aradu.01上有2個，Aradu.04、 Aradu.06、 Aradu.07和Aradu.10上各有1個，而Aradu.03和Aradu.05則沒有。B基因組中有16個，不均勻地分布于7條染色體上，Araip.07和Araip.09上最多，各有4個；Araip.01、Araip.02和Araip.06上各有2個，Araip.04和Araip.10上各有1個，而Araip.03、 Araip.05和Araip.08上則沒有。

2.3 AhFAD跨膜區(qū)與亞細胞定位分析

用軟件對31個AhFAD蛋白進行跨膜區(qū)和亞細胞定位預測（表1），發(fā)現(xiàn)不同亞家族的跨膜區(qū)和亞細胞定位均有不同。AhSAD的跨膜區(qū)數(shù)目最少，為0～1個；AhFAD2跨膜區(qū)最多，為5～6個；AhFAD3～AhFAD8跨膜區(qū)有3～4個。亞細胞定位預測表明，AhFAD2和AhFAD3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，而其它亞家族蛋白定位于葉綠體上。

2.4 基因結(jié)構(gòu)分析

AhFAD亞家族基因結(jié)構(gòu)分析顯示，它們具有明顯不同的特點（表1，圖1）。AhSAD和AhFAD2外顯子數(shù)目最少，為1～4個；ω-3 FAD家族（AhFAD3、AhFAD7/8）外顯子數(shù)為7～9個；AhFAD4/5家族的外顯子數(shù)目均為5個；AhFAD6家族的外顯子數(shù)目差異較大，Araip.AML9J有10個，Aradu.UT0N9只有6個，分析由測序結(jié)果不完全造成。通過對比發(fā)現(xiàn)，AhFAD6和ω-3 AhFAD家族（FAD3、FAD7/8）外顯子數(shù)目較多，結(jié)構(gòu)復雜，AhFAD4/5次之，AhSAD和AhFAD2結(jié)構(gòu)最為簡單。

2.5 系統(tǒng)進化分析

將23條完整AhFAD的氨基酸序列與其他物種65條序列構(gòu)建進化樹（圖2）。發(fā)現(xiàn)無論是單子葉植物還是雙子葉植物，F(xiàn)AD均根據(jù)蛋白是否與膜結(jié)合分為兩大分支：游離SAD單獨分為一支，其他膜結(jié)合FAD位于另一大分支。

SAD分支中，單子葉植物和雙子葉植物分別位于兩個不同的分支。膜結(jié)合FAD分支基本分為3大類：位于最上游分支的FAD4/5家族，中間ω-6 FAD家族系列，以及分支末端的ω-3 FAD家族。ω-6 FAD家族中質(zhì)體FAD6亞家族和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)FAD2亞家族分別聚類于不同分支，ω-3 FAD家族中FAD3與FAD7/8亦是如此。由此推斷，植物膜結(jié)合FAD起源于SAD，膜結(jié)合FAD亞家族中FAD4/5起源最早，ω-3 FAD家族由ω-6 FAD進化而來，根據(jù)定位不同兩個ωFAD家族又可分為質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩小類。從單子葉、雙子葉方面來看，每個FAD亞家族又聚類為單子葉植物和雙子葉植物兩個分支?；ㄉc其他植物進化分支一致，與豆科植物親緣關(guān)系較近。

2.6 表達模式分析

根據(jù)花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（NCBI：PRJNA354652）對AhFAD基因的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)各個亞家族之間的表達模式存在很大差異（圖3）。

在AhSAD家族中，Aradu.L1M1M和Araip.6S389在4個組織中均有表達，但是在Seed2中表達量最高，由此可見這兩個基因在花生生長發(fā)育和種子脂肪酸積累中具有關(guān)鍵作用。6個AhFAD2基因中，Araip.S3GXY在Seed2中表達量最高，表明該基因是催化花生種子中亞油酸合成的主要基因；Araip.D6HPL在葉中表達量最高，說明該基因主要參與葉中亞油酸合成。4個AhFAD3基因中，Aradu.5N10F相對于其它3個基因表達量最高，特別是在Seed2階段。AhFAD4/5和AhFAD6基因家族表達模式類似，在葉中的表達量較高，表明它們對葉片中UFA合成具有重要作用。4個AhFAD7/8基因中，Aradu.AV1HQ和Araip.92Q2X主要在葉中表達，說明二者主要在葉片的UFA合成中具有重要作用。

在Seed2和葉中表達的AhFAD基因數(shù)目較多，表達量較高，說明這2個組織是UFA需求較多的部位。并且在Seed2階段，2個AhSAD和1個AhFAD2的超高表達應該是花生種子中C18∶1和C18∶2占油脂總量80%的原因。

2.7 保守結(jié)構(gòu)域分析

分析FAD家族的保守結(jié)構(gòu)域（圖4）發(fā)現(xiàn)，AhSAD的Motif 1保守結(jié)構(gòu)域中含有第一個Fe原子配基E12和H49，Motif 2保守結(jié)構(gòu)域含有另一個Fe原子配基E7和H48，兩個Fe原子通過Motif 1和Motif 2中兩個連橋配基（E46和E45）連接形成 Fe-O-Fe二鐵氧簇（diiron-oxo cluster）結(jié)構(gòu)（圖4A）；SAD 保守區(qū)4個重要的α螺旋束α3（α3a 和 α3b）、α4、α6和α7及其側(cè)鏈將二鐵氧簇結(jié)構(gòu)深埋其中構(gòu)成酶活性中心。

AhFAD2、AhFAD3和AhFAD7/8序列相對保守，Motif 1和 Motif 2中分別含有花生Histidine box 3兩端特有保守側(cè)翼結(jié)構(gòu)序列FXXXPHYHXXEA和EWXXLRGXLXT，Motif 4和Motif 5分別包含了Histidine box 1（XHXCGHX）和Histidine box 2（WXXSHRXHH）兩個組氨酸富集區(qū)。FAD4/5和FAD6與其他膜結(jié)合FAD亞家族差異明顯，其中FAD6家族只含有Histidine box 1和Histidine box 2兩個組氨酸富集區(qū)；而FAD4/5差異最大（圖4B），缺失組氨酸富集區(qū)。

2.8 可變剪接分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析AhFAD基因的可變剪接事件，發(fā)現(xiàn)共有12個AhFAD基因發(fā)生可變剪接事件，其可變剪接形式差異明顯（表2）。共發(fā)生5種類型的可變剪接：轉(zhuǎn)錄起始位置可變剪接（TSS）、轉(zhuǎn)錄終止位置可變剪接（TTS）、外顯子跳躍（ES）、內(nèi)含子滯留（IR）和可變外顯子 5′或3′端剪接（AE）。其中發(fā)生最多的是TSS和TTS，分別為20次和18次；其次是IR，發(fā)生12次；AE和ES分別發(fā)生5次。

AhSAD亞家族有兩個基因僅發(fā)生了TSS和TTS；AhFAD2亞家族中2個基因都發(fā)生了TSS和TTS，其中Aradu.G1YNF在Seed1中還發(fā)生ES；AhFAD3家族3個基因發(fā)生了可變剪接，Aradu.5N10F只在Seed1中發(fā)生TTS，Araip.84LR8在根中發(fā)生TTS、TSS和IR，Araip.CGW17則在Seed1和Leaf兩個組織中分別發(fā)生ES和TSS；FAD4/5基因家族有一個基因Aradu.42SWI在Leaf中發(fā)生ES、TSS和TTS；FAD6和FAD7/8基因家族都存在四種可變剪接形式，分別為TSS、TTS、IR和AE。

3 討論與結(jié)論

FAD基因在UFA合成中起關(guān)鍵作用，其功能一直是研究熱點。水稻、芝麻、油桐等植物中相關(guān)基因已被克隆并進行了功能驗證[1，9，22]花生中部分FAD基因已經(jīng)被克隆并在微生物或模式植物煙草中進行了功能驗證，但對花生基因組中所有FAD基因家族的系統(tǒng)分析卻較少。

曾有報道將部分植物和微生物FAD氨基酸序列進行進化分析，發(fā)現(xiàn)SAD起源最早，原核生物ω-3 FAD由ω-6 FAD進化而來，植物ω-3 FAD功能的分化早于單雙子葉植物分化，而FAD2功能分化出現(xiàn)于雙子葉植物形成之后[23]。通過將AhFAD序列及其他20多種單子葉植物和雙子葉植物物種FAD序列構(gòu)建進化樹發(fā)現(xiàn)植物ω-3 FAD位于ω-6 FAD分支下游，預示著植物ω-3 FAD由ω-6 FAD進化而來，F(xiàn)AD4/5起源早于ω FAD。且同一基因家族單雙子葉聚類于不同分支說明FAD可分為單子葉和雙子葉植物 2 個亞類。但研究FAD具體進化機制需要將真核和原核生物結(jié)合，把所有動植物和微生物中已發(fā)現(xiàn)的FAD基因結(jié)合進行進化研究。

單外顯子基因是原核生物的一個重要特征，從真核酵母開始出現(xiàn)斷裂基因，其外顯子數(shù)目少且序列短，單內(nèi)含子偏向基因的5′端；高等真核生物基因外顯子增多，尤其是哺乳動物多達十幾個[24]。有研究表明隨著真核生物的基因組增大，其內(nèi)外顯子數(shù)目和重復序列都會增加，但并不是生物越高等， 基因中的外顯子數(shù)就越大[25]。基于這一觀點分析AhFAD結(jié)構(gòu)，AhFAD6和ω-3 AhFAD外顯子數(shù)目最多，結(jié)構(gòu)最為復雜，AhFAD4/5家族次之，AhSAD和AhFAD2外顯子數(shù)目最少，結(jié)構(gòu)最簡單。此結(jié)論無法推斷AhFAD外顯子數(shù)目與進化關(guān)系，這有待于將外顯子、內(nèi)含子、重復序列、保守域等相結(jié)合開發(fā)更精確的分析軟件和新算法來研究。

與棉花、玉米、橄欖等其他高等植物SAD保守序列相同[26-28]，所有AhSAD均具有酶活性中心的4個α-螺旋保守結(jié)構(gòu)域，說明其能構(gòu)成△9-SAD脫氫酶活性中心，能結(jié)合底物促進油酸合成。不同亞家族保守域差異明顯，同為ω-6家族的AhFAD6家族與AhFAD2保守域差異大，說明兩者在進化過程中分歧較大。ω-3 AhFAD亞家族高度保守，均含有3個組氨酸富集區(qū)[29]，AhFAD4/5亞家族則缺失組氨酸富集區(qū)。酶與底物的緊密結(jié)合和功能的發(fā)揮與酶活性中心密切相關(guān)，基因保守結(jié)構(gòu)域是酶活性的重要保障，花生FAD基因保守結(jié)構(gòu)域差異反映出酶具有不同的進化功能。

表達模式分析表明AhFAD家族表達模式存在明顯差異，AhSAD、AhFAD2和AhFAD3在種子中的表達水平大于根和葉，尤其是種子后期，這說明3個家族主要參與種子后期不飽和脂肪酸積累。AhFAD4/5、AhFAD6、AhFAD7/8在葉中表達量最高，說明3個家族主要作用于葉中不飽和脂肪酸合成，結(jié)果與水稻和大豆的表達模式一致[30，31]。有文章報道水稻FAD2基因在葉中表達量最高[32]，這可能與物種及基因的組織特異性表達以及取材時期不同有關(guān)。

小鼠中ES造成Fads3缺失37個aa，可變剪接體Fads3 AT9在組織中的高表達對長鏈PUFA的合成具有重要作用[15]。狒狒中多外顯子跳躍產(chǎn)生新轉(zhuǎn)錄本FADS2 AT1，該基因的組織差異表達模式調(diào)節(jié)長鏈PUFA合成[33]；FADS3有7種剪接異構(gòu)體，其中FADS3 AT1的高表達與4個FADS3 AT的協(xié)同表達共同參與PUFA的形成[34]。花生FAD基因家族TTS和TSS是發(fā)生最多的可變剪接事件，其次是IR，最少的是AE和ES，這與動物FADS有很大差異，分析可能是物種特異性差異造成的。但AS可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)異構(gòu)體和信號分子的模板，在AhFAD基因功能發(fā)揮中具有重要作用。

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